组蛋白去甲基化酶GASC1维持食管癌肿瘤干细胞及其抑制剂抗肿瘤分子机制研究

发布时间：2020-07-06 17:57

【摘要】：食管癌是全球最常见的第六大癌症,其发病率我国最高,新确诊的食管癌患者,每年有50%以上来自中国。食管癌预后极差,多数就诊时已为中晚期,五年生存率仅10%左右~([1])。显著的地域性分布差异性是食管癌流行病学的突出特征,高、低发区之发病率差异可达500倍。以河南省为例,河南北部的林州、安阳等地是中国也是世界食管癌发病率和病死率最高的地区~([2])。半个世纪以来,经过数代肿瘤学临床先辈与防治专家艰苦卓绝的攻关探索,在食管癌的诊疗与预防方面取得了举世瞩目的成绩,但该肿瘤发病机制复杂,防治研究的工作非常艰巨,食管癌发生演进的分子机制亟待有所突破~([3])。组蛋白去甲基化酶GASC1,也称KDM4C,鳞状细胞癌扩增基因1(Gene Amplified in Squamous Cell Carcinoma 1,GASC1),最初是从低分化食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞系KYSE-150中克隆出来的一个高度扩增的基因~([4])。研究显示,GASC1通过H3K9信号通路,对胚胎干细胞的关键调节因子(如NANOG、NOTCH1、SOX2和OCT4等)进行转录后修饰,从而对于维持胚胎干细胞自我更新和分化潜能起至关重要的作用~([5,6])。食管鳞状上皮正常情况下不断自我更新,需要正常干细胞或早期祖细胞利用其高度增殖分化潜能,来维持食管粘膜不断脱落与更新。癌症干细胞(Cancer stem cells,CSCs)学说认为肿瘤细胞内存在着“干性”细胞,负责肿瘤的生长、转移和复发~([7-9])。多能胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)H3K9的甲基化状态维持是通过转录因子和组蛋白去甲基化酶活性间复杂的相互作用~([10,11])。作为H3K9去甲基化酶GASC1,研究显示其与维持胚胎干细胞的特征至关重要~([6])。但食管癌细胞是否存在CSC细胞亚群,GASC1在食管癌CSC维持中的作用,以及其小分子抑制剂是否具有抗肿瘤效用尚不明确~([12])。因此,本课题拟通过细胞系、动物模型以及临床组织标本,多途径探讨GASC1及其小分子抑制剂在食管癌发生发展过程中的分子机制,阐明新型靶点治疗药物的作用机理,为筛选鉴定食管癌诊治新靶标和新型药物的发现设计提供实验基础。研究目的:GASC1及其小分子抑制剂在食管癌发生发展过程中的作用及分子机制。第一部分:GASC1在ESCC中表达情况及与临床病理特征的关系方法1.利用Western blotting、RT-PCR、免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC),在已建人源ESCC细胞系、正常永生化上皮细胞系、患者源性ESCC原代培养肿瘤细胞株、以及新鲜ESCC癌组织与癌旁正常组织,检测GASC1的表达情况。2.调查GASC1与患者临床病理特征及生存之间的关系,明确GASC1与ESCC恶性表型之间的相关性。结果1.利用Western Blot检测GASC1在4株ESCC细胞系中的2株中表达明显(KYSE-150、KYSE-30),在正常人永生化上皮细胞(SHEE)呈现低水平表达;在5株患者来源原代培养ESCC细胞株中表达3株(EC-1、2、3)。2.利用Western Blot、RT-PCR及IHC方法分别检测GASC1在ESCC癌与癌旁组织的表达情况:在癌与癌旁组织间的表达没有明显差异,但在不同分化程度的癌组织间存在表达差异,分化越差,表达越高。GASC1的表达与患者的淋巴结转移相关:高表达组淋巴结转移率增高。3.总生存率的Kaplan Meier分析表明,2年生存率GASC1阳性组为62.6%,GASC1阴性组为81.6%;GASC1表达增加的肿瘤患者2年总生存率明显低于表达减少的肿瘤患者(P=0.041)第二部分:ESCC-CSC的分离与鉴定方法1.利用干细胞无血清悬浮培养法,观察ESCC细胞系和原代培养细胞株是否可以成球悬浮生长。2.利用流式细胞荧光激活细胞分选法(Fluorescence-activated Cell Sorting,FACS)和Aldefluor干细胞鉴定试剂盒,以乙醛脱氢酶1(Acetaldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)为干细胞分子标志,分别在已建人源ESCC细胞系和患者源性ESCC原代培养肿瘤细胞株中检测和分离ALDH~+细胞亚群。3.利用干细胞无血清悬浮培养法,比较ALDH~+细胞亚群及ALDH~-细胞亚群在体外无血清培养基的悬浮成球能力。4.体内试验:在重症联合免疫缺陷(Severe Combined Immun Deficiency,SCID)裸鼠乳腺脂肪垫皮下接种ALDH~+及ALDH~-细胞,观察移植瘤发生发展情况。5.进一步研究ALDH~+细胞是否具有长期成瘤潜力和自我更新能力,评估子代细胞在连续移植中成瘤能力:从小鼠皮下移植瘤获得父代移植瘤细胞,再次分离单细胞悬浮液,利用FACS分离选ALDH~+和ALDH~-细胞,再次移植到受体小鼠体内,连续获得三代移植瘤模型细胞进行分析。6.再次利用FACS和IHC方法,检测ALDH~+细胞在体内移植瘤“干性”维持情况。结果1.ESCC细胞在干细胞培养基(非粘附、无血清、含生长因子)形成干细胞球体,以KYSE-150,和低分化患者源性ESCC细胞成球能力为著。2.利用FACS方法,检测ESCC细胞系和ESCC原代培养细胞株中ALDH~+细胞亚群(从3.92%到14.7%不等)。KYSE-150细胞ALDH~+比例约为10.1%。3.ALDH~+和ALDH~-子代细胞在非粘附、无血清的条件下培养7天,ALDH~+群体在5000细胞/ml的密度下能够产生较多的细胞球体。从球体分离出的ALDH~+细胞在体外能够自我更新,ALDH~+群体百分率和干细胞球体启动能力显示出几乎无限的增长潜力。4.按照普通培养方法,经过96小时,MTS结果显示,ALDH~+细胞较ALDH~-细胞具有更强的增殖能力。5.软琼脂集落形成实验结果显示,ALDH~+细胞较未分类的ESCC细胞以及ALDH~-形成了更多的克隆,显示出明显增强的增殖能力。6.从高、低分化两位食管鳞癌患者新鲜组织制备食管癌原代细胞,通过ALDEFLUOR?Stem Cell(STEMCELL?TECHNOLOGIES INC)干细胞检测和流式细胞仪筛选,将ALDH~+、ALDH~-细胞,分别以10~2、10~3、10~4、10~5、10~6的细胞浓度接种到SCID裸鼠乳房脂肪垫皮下,每组5只,观察2个月。10~4细胞浓度的成瘤小鼠数目:ALDH~+细胞:5/5;ALDH~-细胞:2/5。10~3细胞浓度的成瘤小鼠数目:ALDH~+细胞:5/5;ALDH~-细胞:0/5。10~2细胞浓度的成瘤小鼠数目:ALDH~+细胞:2/5;ALDH~-细胞:0/5(二个月内没有肿瘤形成)。10~6细胞浓度的成瘤小鼠数目:ALDH~+细胞:5/5;ALDH~-细胞:5/5,但ALDH~+细胞在小鼠体内形成肿瘤的体积、重量以及肿瘤生长的速度均大于ALDH~-细胞。7.利用FACS检测裸鼠移植瘤细胞ALDH活性,显示ALDH~+衍生的移植瘤依然保持着较高的ALDH~+细胞亚群;HE和IHC结果显示,由ALDH~+细胞形成的肿瘤组织学和GASC1抗原特征类似于原发肿瘤。第三部分:GASC1参与ESCC-CSC的维持方法1.明确GASC1在ESCC干细胞的表达:利用qPCR和Western blotting,检测了GASC1在ESCC细胞系及原代培养细胞株ALDH~+和ALDH~-细胞的表达情况。2.明确GASC1对ESCC普通培养细胞系的作用:构建GASC1慢病毒干扰载体敲减GASC1基因表达,利用qPCR和Western blotting验证敲减效;联合GASC1抑制剂咖啡酸(Caffeic acid,CA)处理,观察GASC1基因敲减或CA抑制其表达对ESCC细胞克隆形成能力(平板克隆试验)、细胞增殖能力(MTT试验)、细胞周期(流式细胞仪分析)的影响。3.明确GASC1对ESCC干细胞“干性”维持的作用:体外实验:根据干细胞“静止”在G0G1期的特征,利用流式细胞仪分析GASC1基因敲减或CA抑制下细胞周期特点的变化;运用FACS及Aldefluor分析法,分析ESCC富集培养干细胞在GASC1基因敲减及CA处理下ALDH~+亚群比例的变化;观察其非粘附性无血清体外干细胞培养方法下ALDH~+亚群成球能力和自我更新能力的变化。4.体内试验:经SCID裸鼠乳房脂肪垫分别皮下种植ESCC亲本细胞、GASC1慢病毒敲减细胞和CA处理后细胞,观察移植瘤潜伏期和生长速度,以明确GASC1对原位肿瘤的作用;经SCID裸鼠鼠尾静脉注射ESCC亲本细胞、GASC1慢病毒敲减细胞和CA处理后细胞,观察裸鼠肺转移瘤形成情况,以明确GASC1对转移瘤的作用;在SCID裸鼠食管癌移植瘤模型,经腹腔注射不同浓度CA,观察移植瘤变化,以进一步明确GASC1抑制剂CA的抗肿瘤作用。5.利用FACS和IHC方法,鉴别各实验组移植瘤ADLH~+细胞比例,明确GASC1对ESCC干细胞亚群“干性”维持的作用。结果1.通过FACS方法在原代培养细胞株分选ALDH~+细胞亚群,利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测GASC1在ALDH~+和ALDH~-细胞亚群的表达情况。结果显示,相对于ALDH~-亚群,GASC1在ALDH~+亚群中明显高表达。2.利用RT-PCR和Western Blot证实通过shRNAs慢病毒成功实现GASC1的表达敲减。3.利用平板克隆试验、MTT试验、细胞周期流式细胞仪检测试验,发现GASC1基因敲减或其抑制剂CA处理,引起ESCC各细胞株克隆、增殖、迁移能力下降。4.Aldefluor分析显示GASC1基因敲减或CA处理,导致ESCC原代培养细胞株ALDH~+细胞比例下降,并在非粘附性无血清体外培养下,细胞成球能力下降,在随后的体外连续繁殖中持续下降。5.GASC1对ESCC原位瘤的影响:应用SCID裸鼠移植瘤模型显示,GASC1敲减及CA处理组小鼠肿瘤体积,均较对照组缩小,肿瘤潜伏期延长。6.GASC1对ESCC转移瘤的影响:和对照组相比,GASC1敲减及CA处理组小鼠肺转移瘤数目和体积均下降。7.CA对ESCC裸鼠移植瘤模型的治疗作用:利用CaA腹腔注射,引起小鼠肿瘤体积缩小,且呈剂量依赖性;8周后处死小鼠,与父代肿瘤细胞相比,对照组残余瘤ALDH~+细胞比例稳定;CA处理组呈现ALDH~+细胞比例显著下降。第四部分:GASC1-NOTCH1通路调控食管癌干细胞作用机制方法1.应用Agilent全基因组微阵列分析法,对采用细胞微球悬浮培养法富集的食管癌干细胞KYSE150亲本细胞株(Esopha-sphere GASC1~+)及GASC1沉默细胞株(Esopha-sphere GASC1-)进行分析,评估siRNA干扰下的下调基因。利用GO分析对差异表达基因进行功能注释,应用qPCR进行转录验证,并选取重要转录因子Notch1进行功能学研究。2.检验通过抑制GASC1可导致多能性相关基因下调与组蛋白修饰相关的假设:使用AlphaLISA调查去甲基化抑制剂CA是否影响分选的ALDH~+细胞中全蛋白甲基化状态。使用了定量染色质沉淀技术(qChIP),检测多能相关性基因启动子在GASC1抑制过程中组蛋白的变化。使用抗体进行芯片分析,分别识别H3K9me2或H3K9me3在NOTCH1启动子区域的扩增情况。3.研究CA阻断GASC1脱甲基酶功能是否通过表观遗传学修饰影响异种移植瘤的生长,检测CA是否在体内全面影响H3K9甲基化:利用western blot分析ALDH~+来源的异种移植瘤经CA处理后组蛋白提取物中H3K9甲基化水平。4.验证这些效应是否反映了靶基因在肿瘤生长抑制中的表达:利用IHC法分析NOTCH1和H3K9me3在异种移植瘤中的表达。验证CA处理是否促进了NOTCH1启动子表观遗传标记的改变:利用IHC法检测H3K9me3标记在异种移植瘤中的状态。结果1.Agilent全基因组微阵列分析ALDH~+ESCC-CSCs经GASC1基因敲除和CA处理48小时的细胞,我们确定了694个下调重叠基因。用GO分析功能注释差异表达基因,发现重叠下调表达基因在乙醛脱氢酶(NAD)活性、转录因子结合/干性维持、细胞周期调控和分化等方面具有较强的功能。2.在这些基因中,NOTCH1基因是维持ESCC细胞多能性和自我更新的重要转录因子,它被显著下调,被选作进一步研究的靶标。NOTCH1在KYSE150的表达随着GASC1的敲减或咖啡酸抑制而下调。3.GASC1敲减或咖啡酸处理下调GASC1的表达,造成了NOTCH1启动子H3K9me2/me3水平明显增加,以H3K9me3为著。4.NOTCH1敲减可以引起KYSE150 ALDH~+细胞亚群比例下降,且ALDH~+细胞干细胞悬浮培养成球率下降,而通过NOTCH1过表达联合GASC1敲减修饰细胞,发现NOTCH1表达上调可以补偿GASC1表达下调引起来的“干性削减”。并在体内SCID裸鼠成瘤试验中证实。结论:1.GASC1表达上调与ESCC不良病理表型和不良愈后相关。2.ESCC中存在具有干细胞样特征的CSCs亚群。3.GASC1在ALDH~+亚群细胞中表达增强,抑制GASC1可能通过降低CSCs的维持而影响食管癌的发生发展。4.GASC1抑制剂CA可有效抑制ESCC细胞GASC1的表达,并对肿瘤的生长起抑制作用。5.GASC1可通过多能化相关基因组蛋白启动子上H3K9me3和H3K9me2的去甲基化而正向调节其表达,其下游靶基因NOTCH1在ESCC-CSCs干性维持中起关键作用,通过CA阻断GASC1轴可通过靶基因启动子的表观遗传修饰减少体内ESCC-CSCs。总之,我们的研究结果为发展基于抑制GASC1通路来消除ESCC-CSCs“干性”新的治疗策略提供了理论基础。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
【图文】：

食管鳞癌,正常人,原代培养,细胞

19C1 四株食管鳞癌细胞和一株正常人永生化上皮细胞（SHEE）中的表对照，A：qPCR 分析，B：Western 印迹分析。KYSE-150、KYSE高表达，SHEE 低表达。白在患者来源原代培养 ESCC 细胞株的表达者来源原代培养 ESCC 细胞中表达 3 株(EC-1、2、3)（图 1

患者,表达差异,肌动蛋白,细胞系

1-3 Western 印迹分析 GASC1 在来自患者的 ESCC 原代培养细胞株的表达情150 细胞系 GASC1 表达作为阳性对照，β 肌动蛋白作为对照。EC-1，EC-2，SC1 在 ESCC 患者癌与癌旁组织的表达 Western Blot、RT-PCR 及 IHC 方法分别检测 GASC1 在 ESCC 癌与达情况：在同一患者癌与癌旁组织间的表达没有明显差异，但在的癌组织间存在表达差异，分化越差，表达越高。GASC1 的表达结转移相关：高表达组淋巴结转移率增高。GASC1 与患者不良预

癌组织,患者,表达差异,肌动蛋白

图 1-3 Western 印迹分析 GASC1 在来自患者的 ESCC 原代培养细胞株的表达情况Kyse-150 细胞系 GASC1 表达作为阳性对照，β 肌动蛋白作为对照。EC-1，EC-2，EC-3高表达。4.3 GASC1 在 ESCC 患者癌与癌旁组织的表达利用 Western Blot、RT-PCR 及 IHC 方法分别检测 GASC1 在 ESCC 癌与癌旁组织的表达情况：在同一患者癌与癌旁组织间的表达没有明显差异，但在不同分化程度的癌组织间存在表达差异，分化越差，表达越高。GASC1 的表达与患者的淋巴结转移相关：高表达组淋巴结转移率增高。GASC1 与患者不良预后相关。

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