【摘要】：目的:研究表明乳腺癌组织中存在一群具有CD44+/CD24-表型和自我更新能力等干细胞特性的肿瘤细胞,将此细胞群称为乳腺癌干细胞(Breast Cancer Stem Cells,BCSCs)。对于常规的化疗药物,肿瘤干细胞比其他肿瘤细胞更易产生耐药性,但肿瘤干细胞产生耐药的分子机制尚不明确,因此靶向肿瘤干细胞是目前治疗癌症的重大挑战。吗啡是典型的阿片受体激动剂,外源性吗啡通过模拟体内内源性脑啡肽的作用,激动中枢神经阿片受体,产生镇痛效果。目前临床可被应用于麻醉和缓解癌症转移患者的疼痛。然而,最新研究发现吗啡和抗癌药同时给予癌症患者尤其是有癌症转移的患者时,吗啡在止痛的同时也激动非典型阿片受体信号进而促进肿瘤发展。已有研究证明吗啡可通过激活阿片受体而磷酸化表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Recptor,EGFR),促进肿瘤细胞增殖,增加肿瘤的侵袭性。吗啡也可以通过紫杉醇敏感的G蛋白偶联受体(G Protein Coupled Receptors,GPCRs)和一氧化氮(NO)激活MAPK/ERK通路,促进乳腺癌细胞的增殖。此外,吗啡通过增加神经上皮细胞转化基因1(Neuroepithelial Cell-transforming Gene 1,NET1)的表达量促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。故吗啡临床应用过程中促进肿瘤发展的机制研究备受关注。在本研究中,我们发现吗啡促进乳腺癌细胞的成球能力,上调干性相关转录因子Oct4,Sox2和Nanog的表达量。经吗啡处理的MCF-7细胞中侧群细胞(Side Population,SP)增加,BT549细胞中的CD44+/CD24-比例增加。与此同时,吗啡激活wnt/β-catenin信号通路,诱导上皮细胞向间充质细胞转化,促进转移。吗啡降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性,但吗啡拮抗剂纳美芬可以逆转吗啡诱导的肿瘤干细胞和乳腺癌耐药。另外,在nod/scid裸鼠模型中,纳美芬逆转吗啡促进的肿瘤发生。总之,本研究阐述了吗啡通过促进肿瘤生长和富集肿瘤干细胞而耐药,因此揭示了吗啡的一个全新的角色以及为吗啡的临床应用提供了新的指导。方法:1.通过成球实验检测吗啡对乳腺癌细胞干性特性的影响;利用侧群细胞法检测mcf-7细胞泵出hoechst33342染料进而观察吗啡对肿瘤干细胞的作用;通过流式细胞仪检测bt549乳腺癌干细胞表面分子标记cd44+/cd24-进而检测吗啡对乳腺癌干细胞的影响。2.实时定量rt-pcr(quantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction,rt-pcr)从mrna水平反映吗啡对干性因子oct4,sox2和nanog的mrna水平影响;westernblot法从蛋白水平检测吗啡对oct4,sox2和nanog的表达量的调节。3.mcf-7和bt549细胞分别经0μm、1μm、10μm吗啡处理4天后,通过实时定量rt-pcr检测吗啡对emt过程中相关分子cdh1,cdh2和ctnnb1的mrna水平的影响;利用westernblot法和免疫荧光实验从蛋白水平检测吗啡对e-cadherin,n-cadherin和β-catenin的影响;通过transwell方法检测吗啡对mcf-7和bt549细胞的迁移和侵袭能力的影响;通过核/质分离实验检测吗啡对细胞核中β-catenin表达量变化的影响。4.bt549细胞经0μm、1μm、10μm吗啡处理4天后,再分别联合使用0.5μm阿霉素或10nm紫杉醇各两天,采用mtt法检测不同浓度吗啡对化疗药阿霉素和紫杉醇降低细胞生存能力的影响;westernblot法从蛋白水平检测在化疗药存在时吗啡对凋亡相关蛋白(cleavedparp,cleavedcaspase3)的影响;利用annexinv-fitc/pi双染法检测化疗药诱导的bt549细胞凋亡群体数量在加入吗啡后的变化。5.采用mtt法检测纳美芬是否逆转吗啡对化疗药物阿霉素或紫杉醇降低细胞生存能力的影响。westernblot法从蛋白质水平检测纳美芬对吗啡引起的bt549细胞对阿霉素(或紫杉醇)凋亡蛋白水平降低的影响;利用annexinv-fitc/pi双染法检测纳美芬对吗啡引起的bt549细胞对阿霉素(或紫杉醇)化疗抵抗的逆转作用;利用成球实验检测纳美芬对吗啡引起的bt549细胞抵抗化疗药的逆转作用。6.利用异体种植实验检测吗啡在裸鼠体内对成瘤能力的影响,以及纳美芬对吗啡引起的成瘤能力增强的逆转作用。结果:1.成球实验结果显示,与对照组相比,1μm、10μm浓度的吗啡均促进mcf-7和bt549细胞中乳腺癌干细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞表面标记cd44+/cd24-的结果显示cd44+/cd24-比例在吗啡处理后明显升高;侧群细胞的比例从0.63%±0.3%增加到3.4%±0.15%。2.rt-pcr结果显示在mcf-7和bt549细胞中oct4,sox2和nanog的相对表达量都明显升高;同时westernblot结果也表明吗啡上调oct4,sox2和nanog的表达量。3.与对照组相比,细胞经1μm、10μm吗啡处理后,rt-pcr结果显示吗啡下调cdh1,同时上调cdh2和ctnnb1的mrna水平;westernblot结果显示,e-cadherin的表达量减少,而n-cadherin,β-catenin的表达量增加;免疫荧光实验结果显示,在0μm、1μm和10μm吗啡组中,e-cadherin的表达量逐渐减少,而n-cadherin,β-catenin的表达量逐渐增加;核质分离实验结果显示吗啡上调β-catenin在细胞核中的表达量;transwell实验结果表明,吗啡可增加bt549细胞的迁移和侵袭的能力。4.mtt实验结果显示吗啡并没有改变bt549细胞的生存能力,但在阿霉素或紫杉醇诱导凋亡后,吗啡明显提高bt549细胞的生存能力;westernblot结果显示经1μm、10μm吗啡处理后bt549细胞中的cleavedparp和cleavedcaspase-3的表达量均减少。凋亡实验结果显示bt549细胞被阿霉素或紫杉醇诱导的凋亡可以被吗啡抑制。5.mtt,westernblot和凋亡实验结果显示纳美芬对吗啡引起的乳腺癌细胞对阿霉素或紫杉醇的凋亡减少;成球实验表明纳美芬逆转吗啡引起的乳腺癌干细胞数量增加。6.nod/scid裸鼠成瘤实验结果显示经吗啡处理后nod/scid裸鼠的成瘤能力增强,成瘤率提高,瘤体也有所增大,这些效果可以被吗啡拮抗剂纳美芬所逆转。结论:实验结果表明吗啡可以促进乳腺癌细胞的增殖、上皮-间充质转化、迁移和侵袭,促进肿瘤干细胞特性从而导致肿瘤细胞对化疗药物的抵抗,但是纳美芬可以逆转吗啡引起的乳腺癌细胞对化疗药阿霉素和紫杉醇的耐药性。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
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本文编号：
2748502
