Dectin-1信号促进DCs表达IL-33的作用和机制研究

发布时间：2020-07-13 21:36

【摘要】：研究目的及意义:恶性肿瘤是威胁人类健康与生命的最为严重的疾病之一,免疫治疗是区别于传统治疗方法(手术及放、化疗)的另一种最具有研究前景的肿瘤治疗方法。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是机体中重要的抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells,APCs),DCs与肿瘤的发生、发展有着密切关系,在诱导机体抗肿瘤免疫过程中扮演着重要的角色。它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。DCs被认为是目前已发现的功能最强的APCs。体内抗肿瘤免疫包括细胞免疫和体液免疫,其中细胞免疫在介导DCs疫苗抗肿瘤效应中起着至关重要的作用。近20年以来,人们不断研究以DCs为基础的肿瘤疫苗,用于治疗各种人类肿瘤。2010年,以DCs为基础的疫苗(sipuleucel-T)在前列腺癌的治疗中取得了显著的临床疗效,并被美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准作为首个DC疫苗应用于临床。2012年,在人类卵巢癌的临床试验中表明,DC疫苗能够调动卵巢癌患者体内的抗肿瘤免疫反应。这些研究均表明DC疫苗在临床应用中有着广阔的研究前景和较高的研究价值,但DC肿瘤疫苗的临床疗效依然低下,这限制了其临床研究及应用。因此,阐明DCs和DC疫苗相关的抗肿瘤机制,进一步提高其临床疗效,成为肿瘤免疫治疗研究领域迫切需要解决的问题。我所在的研究团队对Dectin-1信号活化的DCs(Dectin-1-DCs)的抗肿瘤作用和机制有较深入和系统的研究。我们之前的研究发现,Dectin-1-DCs能有效促进Th9细胞的分化,而诱导产生的Th9细胞具有强有效的抗肿瘤免疫效应。为了研究Dectin-1-DCs促进Th9细胞分化的机制,我们通过基因表达谱检测发现,Dectin-1信号激动剂Curdlan成熟的DCs(Cur DCs)表达的IL-33比TNF-α加IL-1β成熟的DCs(BMDCs)明显增多。然而,Dectin-1-DCs高表达IL-33的作用和机制目前尚不清楚。因此,我们进行了如下两部分研究:第一部分:Dectin-1-DCs高表达的IL-33的作用研究研究方法:1.在BMDCs和Cur DCs体外诱导Th9细胞生成的过程中,加入IL33封闭抗体αST2或外源IL-33,检测Th9/IL-9的表达。2.在BMDCs和Cur DCs治疗B16-OVA荷瘤OT-II小鼠的过程中,加入外源IL-33,检测小鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞的类型。3.在BMDCs和Cur DCs治疗B16-OVA荷瘤OT-II小鼠的过程中,加入外源IL-33,检测小鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞的增殖能力和表型。4.构建MPC-11小鼠多发性骨髓瘤模型,检测IL-33对Cur DCs抗肿瘤作用的影响。结果:1.Dectin-1-DCs可诱导Th9细胞生成,αST2处理可抑制Cur DCs诱导的Th9细胞分化和IL-9表达,而加入IL-33则显著促进Cur DCs诱导的Th9细胞分化和IL-9表达。2.免疫Cur DCs和IL-33的小鼠产生更多的IL-9+CD4+、IFN-γ+CD4+和Gzm B+CD4+T细胞。3.IL-33能增强Cur DCs免疫的小鼠的CD4+T细胞的Ki67表达,并能抑制T细胞PD1的表达,且不影响IL-2的表达。4.IL-33联合Dectin-1-DCs能显著抑制小鼠的肿瘤生长。结论:1.IL-33增强Dectin-1-DCs对体外Th9细胞的生成作用。2.IL-33增强Dectin-1-DCs对体内Th9细胞的生成作用。3.IL-33增强Dectin-1-DCs对体内Th9细胞的增殖能力。4.IL-33增强Dectin-1-DCs的抗肿瘤作用。第二部分:Dectin-1-DCs高表达IL-33的机制研究研究方法:1.采用TNFα/IL-1β,Curdlan,GM-CSF,Poly I:C或LPS处理DCs,检测DCs中IL-33的m RNA水平。在DCs成熟的过程中加入Syk特异性抑制剂Piceatannol和Raf-1特异性抑制剂GW5074或其特异性si RNAs,检测DCs中IL-33的m RNA水平和蛋白水平。2.在DCs成熟的过程中加入NF-κB抑制剂Bortizomib(Bor),检测DCs中IL-33的m RNA水平和蛋白水平。采用荧光素酶报告系统检测NF-κB转录因子是否能够直接与IL-33启动子结合并激活其表达。3.分析Cur DCs和BMDCs的基因表达谱,并验证IRF1,IRF4和IRF7的表达水平。使用Dectin-1-/-小鼠体外生成DCs,检测IRF4和IRF7的表达水平。4.在DCs成熟的过程中加入使用Irf4特异性si RNA,检测DCs中IL-33的m RNA水平和蛋白水平。Cur DCs诱导Th9的过程中加入Irf4(si-Irf4)或Il33(si Il33)的si RNAs,检测生成的Il9的m RNA水平。5.在DCs成熟的过程中使用Syk,Raf1和NF-κB的抑制剂和Syk(si-syk)或Raf1(si Raf1)的si RNAs,检测DCs中IRF4的m RNA水平和蛋白水平。加入Il33(si Il33)的si RNA检测DCs中Il33和Irf4的m RNA水平。结果:1.Cur DCs促进DCs表达IL-33。抑制或沉默DCs中Syk或Raf-1后,显著降低Dectin-1-DCs的IL-33表达。2.抑制NF-κB信号,显著降低Dectin-1-DCs的IL-33表达。NF-κB转录因子中只有Rel B能轻微的结合并启动IL-33启动子。3.Cur DCs中IRF4的表达显著增加。Dectin-1-/-小鼠体外生成的Cur DCs的IRF4表达不再升高。4.抑制IRF4的表达,能抑制Curdlan诱导IL-33表达。沉默Irf4或Il33的Dectin-1-DCs,体外生成Th9更少。5.抑制Syk,Raf1或NF-κB能够显著降低Curdlan诱导的DCs表达IRF4。加入Il33(si Il33)的si RNA不影响Irf4的m RNA水平。结论:1.Dectin-1通过Syk和Raf-1刺激IL-33表达。2.NF-κB间接的参与Dectin-1诱导IL-33表达。3.Dectin-1刺激DCs表达IRF4。4.Dectin-1诱导IL-33依赖于IRF4的表达。5.Dectin-1通过Syk/Raf1以及NF-κB信号通路促进IRF4的表达。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.51
【图文】：

第 1 章 绪论抗原，未成熟 DCs 具有较强的迁移能力，成熟 DCs 则能有效激活初始型 T 胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节，在诱导机体抗肿瘤免疫程中起到重要作用[1]。通常情况下，人体内的 DCs 细胞数量很少，只有在抗递呈细胞能正常发挥抗原递呈作用的时候，身体才能有效识别病原，激活获性免疫系统，产生正常的免疫反应。美国杜克大学遗传和细胞治疗学中心的究主任埃利-吉尔波瓦说过：“DCs 是激发机体免疫系统激发抵御癌症侵袭最效的途径之一。” “DCs 作为高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导针对相抗原的高效、特异性 T 细胞免疫应答中起到关键作用。”（如图 1.1）

我们对 WT 和 Dectin-1-/-小鼠的骨髓细胞进行体外培养Cs 和 CurDCs，同时分别将这两种细胞负载 OT-II OVA 抗原肽，再分进行免疫治疗。结果发现，与 PBS 对照相比，BMDCs 则具有一定的应，在一定程度上能够延缓小鼠肿瘤的生长（图 1.2A）；而与 BMDCurDCs 具有更强的抑制肿瘤生长的能力，免疫 CurDCs 的小鼠的肿瘤减小（图 1.2A）。结果表明，Dectin-1 活化的 DCs 在体内能够诱导很瘤治疗效果。为了进一步阐明 Dectin-1 信号在 DC 疫苗发挥抗肿瘤效用，给予小鼠免疫 Dectin-1 基因敲除的 CurDCs 则不能抑制小鼠肿瘤不能产生强有力的抗肿瘤治疗效果（图 1.2A）。因此，这个结果Cs 具有强有效的抗肿瘤作用，并且该作用依赖于 dectin-1 信号[10]。

第 1 章 绪论理接种 B16-OVA 肿瘤的 OT-II 鼠的肿瘤生长曲线。1.1.3.4 Dectin-1 与 DCs 表达 IL-33 的关系在前期研究中，我们在培养 DCs 的过程中，分别加入两种 Dectin-1 的活化剂 Curdlan 及 Scleroglucan，进而活化 DCs 的 Dectin-1 信号。结果发现 CurDCs及 SclDCs 表达的 IL-33 水平远远高于未活化 Dectin-1 信号的 BMDCs。我们进一步通过来自于 Dectin-1-/-小鼠的 DCs 进行验证。当 Dectin-1 基因被敲除后，CurDCs 或 SclDCs 均不再表达 IL-33（图 1.3 A-C）。这些结果表明，DCs 表达IL-33 依赖于 Dectin-1 信号，Dectin-1 信号促进 DCs 表达 IL-33[42]。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 顾嘉钦;朱s

本文编号：2754013