BST2表达与胃癌的关系及侵袭迁移的机制研究

发布时间：2020-07-16 22:27

【摘要】：目的:胃癌的发生发展是一种多机制多因素参与的复杂过程,基因事件在肿瘤的发生发展中扮演着越来越重要的作用,多基因的参与可能是肿瘤发展过程的重要机制。有研究表明,骨髓基质细胞抗原2(Bone marrow stromal cell antigen 2,BST2)基因在多种肿瘤中均有表达上调的现象,可能参与肿瘤的发生发展过程,BST2抗体治疗可抑制肿瘤生长,这些结果提示BST2可以通过改变癌细胞的生物学特性,促进肿瘤发生发展。然而,BST2在胃癌发病过程中的作用机制仍未清晰,有待进一步研究。本研究应用免疫组织化学技术检测BST2蛋白在胃癌组织及相应的癌旁正常胃粘膜组织的表达情况,并分析BST2蛋白表达与胃癌患者临床病理资料的关系。通过RNA干扰技术沉默胃癌细胞的BST2基因,观察胃癌细胞的体外生物学行为的变化,包括细胞周期、增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,并进一步探讨是否参与PI3K/Akt/NF-κB信号通路及EMT转化导致了胃癌细胞的侵袭迁移。由此探讨BST2基因在胃癌发生发展中的作用,期望BST2成为药物治疗胃癌的新靶点,为今后胃癌的基因治疗研究提供新的思路。研究方法:1、采用免疫组化法检测BST2在95例石蜡包埋胃癌组织及76例相应癌旁组织中的表达差异。结合患者的临床病理资料,分析BST2表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期等临床病理参数的关系。2、设计并合成2条针对BST2的siRNA,应用脂质体转染法干扰BST2表达水平较高的两种胃癌细胞SGC7901和MGC803,实验分为未转染组、阴性对照组、BST2-siRNA1组、BST2-siRNA2组,两种细胞平行进行后续实验,观察各组胃癌细胞的生物学行为。(1)、增殖和周期:MTT法检测各组细胞转染后24、36、48、72小时的细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞周期的分布,Western blot检测各组细胞中细胞周期蛋白cyclinA、cyclin D1的表达情况。(2)、凋亡:流式细胞仪检测和Hoechst染色观察各组细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、pro-caspase3和cleaved-caspase3的表达情况;MTT法检测梯度浓度的顺铂处理下细胞的存活情况,得出各组细胞的增殖抑制率,计算出各组药物的IC50,并用IC50浓度的化疗药顺铂处理细胞,通过流式细胞仪和Hoechst染色检测细胞凋亡,评估化疗药物的敏感性。(3)、侵袭迁移:Transwell实验检测各组细胞侵袭能力,细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力;Western blot和明胶酶谱分别检测各组细胞中促侵袭转移蛋白MMP2和MMP9的表达水平和活性;3、侵袭迁移机制研究:(1)、Western blot检测各组细胞信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、IκB-α、p-IκB-α、胞核NF-κB p65蛋白的表达,免疫荧光染色观察NF-κB p65的核转位情况;免疫细胞化学分析各组细胞EMT转化相关蛋白Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表达。(2)、选择BST2表达水平较低的胃癌细胞BGC823和HGC27,转染BST2过表达载体并加入Akt信号通路抑制剂LY294002,实验分为未转染组、未转染+LY294002组、空载体对照组、BST2过表达载体转染组、BST2过表达载体转染+LY294002组。Transwell实验检测各组胃癌细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力;Western blot检测各组细胞中信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、IκB-α、p-IκB-α及胞核NF-κB p65的表达及EMT转化相关蛋白Snail、Slug的表达。结果:1、BST2蛋白在胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织均可见表达,阳性表达主要定位于细胞膜,少量在细胞质。胃癌组织中BST2蛋白的阳性表达率高于相应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P0.05);患者的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、远处器官转移与BST2的蛋白表达水平的相关性差异无统计学意义(P0.05),但TNM分期为I期的患者BST2蛋白的表达水平高于II及III期的患者,差异具有统计学意义(P0.05)。2、四种胃癌细胞BST2表达量由高到低分别为SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27。在SGC7901及MGC803细胞,与未转染组及阴性对照组相比,BST2-siRNA1组和BST2-siRNA2组细胞增殖明显减慢,差异有统计学意义(P0.05);细胞周期均被阻滞在G2-M期,S期细胞明显降低,细胞增殖受到抑制,差异有统计学意义(P0.05);细胞周期相关蛋白cyclin A和cyclin D1的表达量降低明显,差异有统计学意义(P0.05);细胞凋亡的数量和比例上升,差异有统计学意义(P0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2的表达量降低明显,而cleaved-caspase3和Bax的表达量显著上升,差异有统计学意义(P0.05)。应用IC50浓度的顺铂处理各组细胞后,细胞凋亡的数量和比例也同样上升;细胞侵袭和迁移能力下降,差异有统计学意义(P0.05);侵袭迁移相关蛋白MMP2和MMP9的表达水平和活性下降,差异有统计学意义(P0.05)。3、(1)、在胃癌细胞SGC7901及MGC803,与未转染组及阴性对照组相比,BST2-siRNA1组和BST2-siRNA2组细胞p-Akt、IκBα、胞核NF-κB p65蛋白的表达下降,p-IκB-α表达量上升;免疫荧光染色观察NF-κB p65的核转位减少;免疫细胞化学分析结果示Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表达升高,E-cadherin表达下降。(2)、胃癌细胞BGC823和HGC27转染过表达载体后,Western blot结果示,与未转染组及转染空载体对照组相比,BST2的mRNA和蛋白表达升高,细胞的侵袭和迁移能力提高;信号通路相关蛋白p-Akt、p-IκBα及胞核NF-κB p65的表达升高,IκBα表达降低;EMT转化相关蛋白Snail、Slug的表达升高;与BST2过表达+LY294002组相比,BST2的m RNA和蛋白表达下降,细胞的侵袭和迁移能力下降,信号通路相关蛋白p-Akt、p-IκB-α及胞核NF-κB p65的表达降低,IκBα表达升高,EMT转化相关蛋白Snail、Slug的表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1、BST2蛋白在胃癌组织中高表达。2、BST2的表达可以促进胃癌细胞的增殖、减少凋亡、增加侵袭迁移能力。3、BST2参与PI3K/Akt/NF-κB信号通路及EMT转化促进胃癌细胞的侵袭迁移。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

胃癌组织,免疫组织化学法,蛋白,标本

P<0.05 为差异有统计学意义。3 结果3.1 胃癌和癌旁组织中 BST2 的表达情况由于实验过程中的损耗，最终纳入研究的病例标本数目为：胃癌组织95 例，癌旁正常组织标本 76 例。将这些胃癌组织和癌旁正常组织标本根据免疫组化评分标准进行评定。在 95 例胃癌组织中，63 例染色阳性（66.32%例染色阴性（33.68%）；在 76 例癌旁正常组织中，31 例染色阳性（40.80%45 例染色阴性（59.21%）；BST2 蛋白在胃癌组织中的表达率为 66.32%（63/明显高于其相应的癌旁正常胃粘膜组织 40.80%（31/76），且差异具有统计义（p<0.01）。

胃癌细胞

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 筛选 BST2 高表达的胃癌细胞和干扰效果较好的 BST2-siRNA 并沉默胃癌细胞 BST2 的表达3.1.1 SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27 胃癌细胞中 BST2 的表达差异分别通过 Real-time PCR 和 Western blot 检测 SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27胃癌细胞中BST2 mRNA和蛋白的表达水平，从高到低依次为：SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27。筛选出了 SGC7901、MGC803 两种 BST2 相对表达量较高的胃癌细胞进行后续实验。A B C

胃癌细胞,蛋白表达,转染,无明

25Western blot 检测检测 SGC7901 和 MGC803 各组胃癌细胞 BST2 蛋白的表达水平转染组相比，control-siRNA 组细胞中 BST2 蛋白表达无明显变化(P>0.05)，RNA1 组和 BST2-siRNA2 组细胞中 BST2 mRNA 相对表达量明显下降(P＜0.05)。空ontrol-siRNA 组、BST2-siRNA1 组、BST2-siRNA2 组与内参β-actin 比值分别为：1 组细胞：2.04±0.32、2.19±0.46、0.74±0.45、0.81±0.50；MGC803 组细胞：0.66±0.09、3、0.27±0.17、0.15±0.09。（***P＜0.001）制 BST2 表达对 SGC7901 和 MGC803 胃癌细胞增殖和周期的TT 法检测各组细胞的增殖情况

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