氨基酸转运载体SLC1A5对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制研究

发布时间：2020-07-16 22:36

【摘要】：研究背景胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤,因肿瘤导致的死亡率长期居高不下,位列人类恶性肿瘤致死率第二位。由于进展期胃癌患者死亡率较高,预后较差,我们需要进一步研究胃癌的发生发展机制,并从胃癌组织和细胞中找寻新的诊断和治疗靶点,进一步阐述胃癌的发病机制,并通过对相关靶点的进一步分析研究,来指导胃癌的临床诊断和治疗。恶性肿瘤能量代谢异常也被认为恶性肿瘤十大特征之一。新的观点认为恶性肿瘤是一种代谢性疾病。旺盛的谷氨酰胺代谢是恶性肿瘤的重要特征。肿瘤由于其快速增殖,需要摄取更多的谷氨酰胺,而细胞外的谷氨酰胺必须借助于细胞膜上的一系列氨基酸转运载体才能进入细胞内,因此,肿瘤组织可能通过高表达相关氨基酸转运载体促进谷氨酰胺转运。溶质载体家族1成员5(Solute Carrier Family 1 Member SLC1A5),是氨基酸转运载体家族中的重要一员。主要转运包括谷氨酰胺在内的多种小分子中性氨基酸。不少研究表明SLC1A5在多种恶性肿瘤组织和细胞中高表达,并且与肿瘤增殖、侵袭及预后不良有关,体内外研究表明抑制SLC1A5可抑制肿瘤细胞生长。目前尚无关于SLC1A5和胃癌的相关研究。本实验分三个部分:第一部分研究SLC1A5蛋白表达与胃癌临床病理特征的相关性;第二部分研究体外实验中SLC1A5对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制;第三部分研究体内实验中SLC1A5对肿瘤生长的影响。第一部分SLC1A5蛋白表达与胃癌临床病理特征的相关性分析目的:观察SLC1A5蛋白在胃癌组织表达及其与胃癌临床病理特征的相关性分析。方法:采集进展期胃癌病理组织及对应癌旁组织70例,应用免疫组化技术检测SLC1A5在上述组织中的表达情况,并统计分析其表达强度与胃癌临床病理特征的关系。并通过基因数据库分析SLC1A5在胃癌组织和癌旁组织中表达情况及其对胃癌患者生存期的影响结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中SLC1A5表达显著增高(P0.0001)。GSE数据库研究证实SLC1A5在胃癌组织中表达明显升高(GSE 65801,P=0.0046;GSE63809,P0.0001;GSE 27342,P=0.0147)。胃癌组织中SLC1A5高表达与肿瘤大小(P0.05)、肿瘤浸润深度(P0.001)、淋巴结转移(P0.05)、TNM分期(P0.05)和Ki-67(P0.01)相关,而与年龄、性别、肿瘤位置及分化程度无关。SLC1A5表达强度与预后相关,可明显缩短患者的总体生存期(GSE 14210,P=0.0.011;GSE 22377,P=0.0.0015),同时缩短患者的无进展生存期(GSE 14210,P=0.0.0095;GSE 22377,P=0.0.0012)结论:SLC1A5蛋白在胃癌组织中表达升高,SLC1A5表达与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期相关。SLC1A5可作为胃癌诊断和判断预后的新靶点。第二部分SLC1A5对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制目的:研究SLC1A5对胃癌细胞增殖能力、细胞周期、细胞侵袭和迁移的影响,并探讨SLC1A5与m TOR/p70S6K信号通路的关系。方法:通过免疫印迹法检测五种不同胃癌细胞株中SLC1A5的蛋白表达水平差异。通过慢病毒载体感染胃癌细胞敲低SLC1A5基因后,用CCK-8法检测SLC1A5对胃癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测SLC1A5对胃癌细胞周期的影响,Transwell小室实验检测SLC1A5对细胞侵袭和迁移的影响,免疫印迹法检测SLC1A5对m TOR、p-m TOR、p70S6K、p-p70S6K、Cyclin D1蛋白表达的影响。结果:SLC1A5在胃癌细胞株HGC-27和MGC-803中表达较高。用慢病毒载体感染胃癌细胞敲低SLC1A5后可明显降低胃癌细胞增殖能力,导致细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞侵袭和迁移,抑制m TOR/p70S6K信号通路,并下调Cyclin D1蛋白表达。结论:SLC1A5可促进胃癌细胞生长和侵袭。其机制与促进m TOR/p70S6K信号通路有关。SLC1A5有望成为未来胃癌治疗的新靶点。第三部分SLC1A5对小鼠体内胃癌细胞生长的影响目的:研究SLC1A5对小鼠皮下胃癌细胞生长的影响。方法:选取4-6周龄雄性BALB/c裸小鼠,随机分为两组,分别在其背侧肩胛下缘注射合成的阴性对照慢病毒转染胃癌细胞株HGC-27悬液(对照组)和慢病毒转染敲低SLC1A5后获得稳转的人胃腺癌细胞株HGC-27悬液(实验组)。定期测量裸鼠肿瘤长径和短径,计算肿瘤体积;20天后处死裸鼠,分离肿瘤组织,用免疫印迹法检测瘤体组织内SLC1A5的蛋白表达情况。结果:SLC1A5可明显促进胃癌细胞在小鼠体内的生长(P0.0001),在荷瘤成功后第10天即有明显差异(P0.0001)。免疫印迹法表明实验组瘤体组织中的SLC1A5表达较对照组明显下调。结论:SLC1A5可促进胃癌细胞在小鼠体内的生长。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

进展期胃癌,表达强度,胃癌组织,胃癌

南京医科大学博士学位论文结果1．SLC1A5 在进展期胃癌组织和癌旁组织中的表达情况观察 SLC1A5 在进展期胃癌组织中的表达情况，癌旁组织作为对照组。与癌旁组织相比，胃癌组织中 SLC1A5 表达显著增高（P<0.001）（图 2A,2C,2D），SLC1A5 在组织中表达强度判定标准见图 2B。GSE 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据统计分析证实 SLC1A5 在胃癌组织中表达明显升高（GSE 65801, P =0.0046；GSE63809，P<0.0001；GSE 27342，P=0.0147）（图 2E,2F,2G）。

胃癌,患者预后,表达强度,发病率

图 3 胃癌中 SLC1A5 表达强度与患者预后的关系。胃癌 SLC1A5 表达强度越高，预越差。总体生存期（GSE 14210，P=0.0.011；GSE 22377，P=0.0.0015），无进展存期（GSE 14210，P=0.0.0095；GSE 22377，P=0.0.0012）讨论在我国，胃癌的发病率常年居高不下，发病率处于所有恶性肿瘤的第二位，

胃癌细胞株,慢病毒,转染,质粒载体

图 1 SLC1A5 在不同胃癌细胞株中的表达情况慢病毒质粒载体转染SLC1A5表达较高的两种细胞细胞株（HGC03）用慢病毒质粒载体转染两种胃癌细胞株，转染后观察细胞荧光表达效率。（图 2）

【参考文献】