基于FRET的Aptamer探针和分析方法构建及其肿瘤高灵敏检测研究

发布时间：2020-07-16 23:08

【摘要】：发展高特异性的分子识别探针及高灵敏的分析检测方法对实现肿瘤的早期诊断、转移预警和疗效评估等具有非常重要的意义。核酸适配体(Aptamer)作为一种新型的能特异识别肿瘤细胞及相关肿瘤标志物的分子识别探针,具备高亲和力、高特异性、易合成、易修饰、性质稳定、设计灵活等优势,已在肿瘤的分子诊断、靶向治疗及相关基础研究中显示出独特优势和重要应用价值。然而,目前常用的基于Aptamer的肿瘤分析检测往往存在检测背景高、设计困难和检测灵敏度不高等缺点;此外,现有的肿瘤细胞特异性Aptamer数量及其靶标信息仍非常有限,严重限制了Aptamer的广泛应用。基于此,本论文针对上述关键性问题,以发展新型肿瘤高灵敏检测探针和分析方法为目标,采用肿瘤细胞特异性Aptamer,通过引入荧光共振能量转移(FRET)信号转换机制和杂交链式反应(HCR)放大机制,构建和发展了一系列低背景、高信号输出的Aptamer荧光探针和分析方法,系统地开展了肿瘤细胞的高灵敏检测、肿瘤细胞表面特异性糖基化增强性成像以及转移肿瘤细胞和组织特异性成像研究。具体研究内容如下:一、基于裂开型Aptamer的发夹式荧光探针设计及用于肿瘤细胞检测研究针对常规Aptamer荧光探针一般依赖于Aptamer整个分子进行设计而导致的序列较长和设计困难等问题,本章基于FRET技术和裂开型Aptamer,设计和发展了一种发夹式裂开型Aptamer荧光探针(HSAP)用于肿瘤细胞的灵敏检测。该探针不仅序列短,且设计简单方便,背景信号低。以人肝癌SMMC-7721细胞为检测靶细胞,HSAP可在100μL结合缓冲液中最低检测到24个细胞,且能够在50%人血清复杂样品中实现靶细胞的定量检测。同时,HSAP具有良好的选择性,能够特异性识别混合细胞样品中的靶细胞。此外,该探针可在15分钟内实现对靶细胞的一步式检测,而无需任何洗涤和预处理。这种快速、简便、灵敏和特异性的肿瘤细胞检测探针为肿瘤和医学诊断研究提供了一种有力的工具。二、基于靶标诱导双链式裂开型Aptamer荧光探针重组装高灵敏检测肿瘤细胞研究上述发夹式Aptamer荧光探针是一种基于分子内FRET模式的检测探针,虽然靶标结合能够诱导探针构象变化而产生信号,但由于淬灭基团仍位于探针上,在一定程度上仍有FRET发生,导致探针荧光不能够完全恢复。针对此问题,本工作设计了一种基于分子间FRET的双链式裂开型Aptamer荧光探针(DSAP)用于肿瘤细胞高灵敏检测。在自然状态下,DSAP由于发生FRET,荧光被淬灭;当靶细胞存在时,靶细胞结合诱导DSAP发生重组装,使带淬灭基团的序列从双链探针上解离,从而使荧光完全恢复,产生强烈的荧光信号,大大提高了检测灵敏度。此外,通过在裂开型探针上分别标记不同的荧光分子,可进一步实现对靶细胞的双信号检测,有效地避免假阳性和假阴性信号。该方法简单、快速、无需洗涤和分离,灵敏度高,检测信背比高达40倍,可实现对100μL结合缓冲液中7个肿瘤细胞的检测,并且还进一步实现了含50%人血清复杂样品和混合细胞的检测,有望为肿瘤细胞的临床诊断和研究提供一种新的高灵敏技术和方法。三、基于FRET和代谢糖标记技术的Aptamer导向的肿瘤细胞表面特异性糖基化成像研究异常的细胞表面糖基化通常与肿瘤的早期发生高度相关,对肿瘤细胞表面糖基化进行特异性成像对肿瘤的早期检测意义重大。然而,由于糖分子非模板合成和构象复杂的特点,以及其传统靶向分子单一、选择性不高等缺点,难以实现特异性糖基化检测。基于此,本工作采用简单高效的代谢糖标记技术标记糖分子,并以糖蛋白特异性的新型Aptamer为靶向分子,结合FRET信号转换机制,发展了一种新的细胞表面蛋白特异性糖基化成像方法。该方法通过代谢糖标记技术在靶糖蛋白上标记FRET供体和在Aptamer上标记FRET受体,成功实现了SMMC-7721细胞表面靶糖蛋白特异性的N-乙酰半乳糖胺化(GalNAcylation)成像。该方法不仅成像对比明显,而且具有很高的选择性,为肿瘤细胞表面糖基化荧光成像分析提供了一种新的思路和方法。四、基于Aptamer引发的HCR扩增用于肿瘤细胞表面特异性糖基化增强性成像研究糖蛋白一般含有大量的单糖单元,通过代谢糖标记技术标记的FRET供体数量远远高于其结合靶向分子上的受体数量,巨大的受体和供体数量差异不利于高FRET信号的获取。针对此问题,本工作结合HCR扩增放大技术,设计了一种Aptamer-Trigger嵌合体探针,构建了一种Aptamer连接的DNA纳米组装体探针。该纳米探针携带多个FRET受体基团,并可通过改变HCR构建单元的序列长度使受体基团合理分布,与代谢糖标记技术标记的多个FRET供体发生FRET作用,大大增强了FRET信号。利用该方法成功实现了SMMC-7721细胞表面蛋白特异性的GalNAcylation增强成像,相对于非增强性成像方法,其FRET信号增强约两倍。此外,该方法还具有很好的通用性,不仅可以实现CCRF-CEM细胞表面蛋白酪氨酸激酶-7(PTK-7)特异性的唾液酸化(Sialylation)成像,还能够准确监测药物处理后PTK-7特异性的Sialylation表达变化,有望作为一种新的高灵敏分析方法用于肿瘤细胞表面特异性糖基化检测。五、转移结肠癌LoVo细胞Aptamer的筛选及用于转移肿瘤细胞和组织特异性成像发展不同靶标特异性的Aptamer分子可为肿瘤检测研究提供更多可供选择的识别探针。转移肿瘤细胞可产生于肿瘤发生早期阶段,实现转移肿瘤细胞检测对肿瘤的早期诊断意义重大。本研究工作利用cell-SELEX技术,以人转移结肠癌LoVo细胞为正筛细胞,以人非转移结肠癌细胞SW480为负筛细胞,筛选获得了4条能够高亲和力结合LoVo靶细胞的Aptamer,其解离平衡常数(K_d)均在纳摩尔级,酶解实验初步证明这4条Aptamer的靶标分子均为蛋白质。实验结果表明,其中一条J3 Aptamer不仅能够识别靶细胞,还可识别多种转移肿瘤细胞。将J3标记上Cy5近红外荧光染料后,成功实现了转移肿瘤细胞和非转移肿瘤细胞之间的对比成像。此外,J3-Cy5还可特异性识别病人转移结肠癌组织,识别率高达73.9%,而对非转移结肠癌组织和癌旁组织的识别率较低。本工作筛选得到的J3 Aptamer有望作为一种新的分子识别工具用于转移肿瘤的特异性检测,在肿瘤转移预警应用中具有重要的价值。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.4;O657.3
【图文】：

肺肿瘤

博士学位论文（CT）、磁共振成像（MRI）、超声成像和核成像等。传统的影像学肿瘤检测方法虽然能够实现肿瘤的无创检测，提供肿瘤相关信息，但这些方法的分辩率有限，不能对较小的病灶（厘米级以下）进行准确的检测，故不能满足肿瘤早期检测的需求。近年来迅猛发展的分子影像学检测方法，可对肿瘤相关异常分子进行特异性成像检测，其检测灵敏度相比传统成像方法有明显改善，可有效地在分子微观水平上为肿瘤检测提供更加全面和精确的信息[15, 16]。结合传统的影像学方法，分子影像检测方法已经被广泛应用于肿瘤的诊断、治疗和预后判断。其中，荧光分子成像因其独特的优势，在医学和生物科学领域中发展最为迅速。例如，Grimm等[17]通过荧光分子断层成像技术（FMT），利用鼠肺癌组织过表达的组织蛋白酶能够特异性激活光学探针荧光的特性，实现了鼠肺肿瘤的 3D 荧光成像，可检测到直径为 1 mm 的微小肿瘤（图 1.1）。

方法,肿瘤标志物,检测方法,电化学检测方法

实现了 CTCs 的高效捕获与检测（图1.2C）。目前，肿瘤标志物检测不仅可用于肿瘤的诊断，还可用于肿瘤的预后监测。由于肿瘤标志物是肿瘤在细胞和分子水平上的异常体现，肿瘤标志物可更加准确、灵敏地预示肿瘤的早期发生、发展过程，因此，肿瘤标志物检测方法在肿瘤的早期诊断领域具有明显的优势。目前，虽然已经发现了一百余种肿瘤标志物，但能够应用于临床诊断的仅有 20 余种，且理想的临床肿瘤标志物更是微乎其微，因此，需要开发更多的优异肿瘤标志物用于肿瘤检测。此外，还需发展高灵敏、高特异性的检测方法，以实现微量肿瘤标志物的有效检测。图 1.2 几种肿瘤标志物检测方法。（A）电化学检测方法[24]；（B）荧光检测方法[25]；（C）微流控芯片检测方法[26]。综上所述，在肿瘤检测中，传统的病理学检测方法结合分子生物学技术可以有效地评估肿瘤，但这些方法需要侵入式取样，给病人带来痛苦，此外取样的局限性也限制了肿瘤的准确诊断；一般的影像学检测可以免侵入地在整体上显示肿瘤的大小和位置等信息，但不能反映具体的肿瘤相关信息，且检测灵敏度有待提

序列,文库,靶标,单链

amer 及其肿瘤检测应用ptamer 简介amer（核酸适配体）是指一类能够高亲和、高特异性结合其靶标列，可从化学合成的 DNA 或 RNA 寡核苷酸文库（约 1012-101得。Aptamer 及其筛选技术分别由美国的 Szostak 和 Gold 课题 1990 年，Gold 课题组首先开创了体外筛选技术，并命名为atic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment），即指数富[27]。SELEX 的大致流程如下：靶标与文库孵育、去掉未结合序序列 PCR 扩增、单链文库制备、下一轮筛选、克隆测序，筛选以提高筛选效率和特异性（图 1.3）。几乎在同时，Szostak 课题筛选技术，以小分子有机染料为靶标，筛选得到了能够特异性片段，并根据拉丁词“aptus”和希腊词“meros”把这些片段命名为意[28]。

【相似文献】