CD133-Pc通过Notch信号通路靶向杀伤结肠癌干细胞的实验研究

发布时间：2020-07-18 12:31

【摘要】：目的研究偶联CD133多肽的酞菁缀合物光敏剂(CD133 polypeptide-phthalocyanine conjugate,CD133-Pc)的光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)对人结肠癌干细胞(Colorectal cancer stem cells,CRC-CSCs)体外生物学特性的影响,并探讨相关分子机制。方法1、CRC-CSCs分离、富集和鉴定。用磁珠分选技术分离出CD133+的结肠癌细胞;用结肠癌干细胞条件培养基悬浮培养,富集和扩增CRC-CSCs;用流式细胞仪检测其表面标志物CD133的表达;用体外极限稀释法验证CRC-CSCs的自我更新能力;用蛋白质免疫印迹检测干性相关蛋白表达;用裸鼠皮下移植瘤模型验证CRC-CSCs的致瘤性。2、观察CD133-Pc细胞内吞和亚细胞定位。将CD133-Pc或Pc孵育结肠癌亲本细胞或CRC-CSCs,用荧光探针定位细胞器,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察CD133-Pc和Pc的细胞内吞和亚细胞定位。3、体外光动力治疗研究。用不同浓度CD133-Pc或传统光敏剂处理永生化结肠上皮细胞、结肠癌亲本细胞或CRC-CSCs后进行激光照射,用Alamar Blue法测定细胞生存活力;用悬浮培养法测定结肠癌细胞的肿瘤球形成能力和CRC-CSCs的自我更新能力;蛋白质免疫印迹检测相关机制的蛋白水平变化;2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)孵育后用流式细胞仪检测ROS水平;用流式细胞仪(AnnexinV/PI染色)检测细胞凋亡;通过ROS抑制剂和自噬抑制剂验证ROS和自噬在光动力治疗中的作用。4、过表达Notch1。用携带嘌呤霉素抗性和过表达Notch1基因的慢病毒载体感染CRC-CSCs,用嘌呤霉素筛选构建过表达Notch1的CRC-CSCs稳定细胞系。结果1、经磁珠分选和无血清超低粘附悬浮培养从人结肠癌亲本细胞HT29和SW620中分离和富集CRC-CSCs;流式细胞术检测CD133表达,分选后HT29和SW620的CD133阳性率分别为86.1%和98.6%;经磁珠分选和超低粘附悬浮培养后,HT29和SW620的CD133、c-Myc、Nanog、Oct-4蛋白水平增加;裸鼠移植瘤实验证实CRC-CSCs较亲本细胞具有高两个数量级的致瘤性。2、CRC-CSCs比结肠癌亲本细胞内吞CD133-Pc效率高;在结肠癌亲本细胞中,高表达CD133的细胞内吞CD133-Pc效率高;在CRC-CSCs中,内吞CD133-Pc效率高于Pc;CD133-Pc聚集在线粒体、溶酶体和内质网中。3、随CD133-Pc的浓度升高,PDT降低结肠上皮细胞、结肠癌亲本细胞和CRC-CSCs的生存活力,但是CD133-Pc PDT对结肠癌细胞的杀伤作用大于永生化结肠上皮细胞;CD133-Pc的杀伤作用强于传统光敏剂Photosan和未偶联CD133的Pc;CD133-Pc PDT对CRC-CSCs的杀伤作用随激光强度增强而增强;在体外,CD133-Pc PDT 1小时细胞即发生形态改变。4、CD133-Pc PDT抑制结肠癌亲本细胞的肿瘤球形成和CRC-CSCs的自我更新能力;CD133-PcPDT降低CRC-CSCs中的Notch1和Nanog蛋白水平;过表达Notch1的CRC-CSCs抵抗CD133-Pc PDT。5、经不同浓度CD133-Pc对CRC-CSCs进行光动力处理,流式细胞仪检测结果显示细胞内ROS水平随CD133-Pc浓度增加而增高;同时Nrf2和Keap1蛋白水平随CD133-Pc浓度增高而增高;添加ROS抑制剂后能够逆转CD133-Pc PDT对CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。6、经不同浓度CD133-Pc对CRC-CSCs进行光动力处理,流式细胞仪检测结果显示细胞的凋亡比例随CD133-Pc浓度增加而增高。7、经不同浓度CD133-Pc对CRC-CSCs进行光动力处理,免疫荧光结果显示随CD133-Pc浓度增加,LC3表达逐渐增多;蛋白质免疫印迹结果显示CD133-Pc PDT促进CRC-CSCs的自噬;添加自噬抑制剂后能够逆转CD133-Pc PDT对CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。结论1.通过磁珠分选CD133+细胞和悬浮培养法分离和富集的CRC-CSCs具有结肠癌干细胞特性。2.CD133-Pc PDT在体外能够有效杀伤CRC-CSCs。3.CD133-Pc PDT的杀伤作用的机制是细胞通过内吞CD133-Pc后,经激光照射产生ROS,抑制Notch信号通路,进而抑制结肠癌干细胞的干性特征和诱导细胞程序性死亡。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35
【图文】：

照片,肿瘤,球形

ＰＣｓ和ＳＷ６２０邋ＰＣｓ中培养出ＣＲＣ－ＣＳＣｓ，即ＨＴ２９ＣＳＣｓ和ＳＷ６２０ＣＳＣｓ。ＣＲＣ－ＣＳＣｓ逡逑在体外培养条件下７天能完全形成肿瘤球，与未经超低粘附悬浮培养的ＰＣｓ形成逡逑明显的形态学差异（图１）。逡逑ＨＴ２９邋ＣＳＣｓ逦ＨＴ２９邋ＰＣｓ逡逑Ｄａｙ１逦Ｄａｙ邋３逦Ｄａｙ邋７逡逑＞邋＾邋＇邋＇邋、Ｊ邋，逡逑＼逦ｙ／．逦卜、逡逑：＞逦：；Ａ：邋）逦３逡逑ｌｌ逦＾逦，邋＇Ｙ」逡逑ＳＷ６２０邋ＣＳＣｓ逦ＳＷ６２０邋ＰＣｓ逡逑Ｄａｙ邋１逦Ｄａｙ邋３逦Ｄａｙ邋７逡逑＿＿邋ｌ邋［逦＾逦z1邋ｆ邋ｒ，邋0逡逑图１来源于ＨＴ２９和ＳＷ６２０的ＣＲＣ－ＣＳＣｓ肿瘤球形成。用无血清超低粘附悬浮培养法从逡逑ＨＴ２９和ＳＷ６２０细胞培养出ＣＲＣ－ＣＳＣｓ。左侧照片显示不同的时间（天）肿瘤球的形成情况。逡逑原放大倍数：２００＞＜。右侧照片显示亲本细胞生长情况。原放大倍数：２０0ｘ。逡逑３．邋１．２邋ＣＲＣ－ＣＳＣｓ邋的鉴定逡逑用抗ＣＤ１３３的ＰＥ荧光抗体标记ＨＴ２９邋ＰＣｓ和ＳＷ６２０邋ＰＣｓ细胞。经磁珠分逡逑选后用流式细胞仪检测细胞的ＣＤ１３３的阳性率。结果显示ＨＴ２９和ＳＷ６２０的结逡逑肠癌干细胞表面标志物ＣＤ１３３＋的细胞分别约占细胞总数的８６．１％和９８．６％邋（图逡逑１３逦＿逡逑

结肠癌,干细胞

图２结肠癌干细胞的鉴定。Ａ：流式细胞术检测磁珠分选前后ＨＴ２９和ＳＷ６２０的结肠癌干逡逑细胞表面标志物ＣＤ１３３的细胞阳性率。Ｂ：蛋白质免疫印迹分析比较ＣＲＣ－ＰＣｓ和ＣＲＣ－ＣＳＣｓ逡逑中ＣＤ１３３和ｃ－Ｍｙｃ的蛋白水平。Ｃ：激光共聚焦显微镜观察比较ＣＲＣ－ＰＣｓ和ＣＲＣ－ＣＳＣｓ中逡逑Ｎａｎｏｇ，邋Ｏｃｔ－４的表达，原放大倍数６３0ｘ。Ｄ：第２５代ＳＷ６２０ＣＳＣｓ用无血清超低粘附悬浮逡逑培养法将ＳＷ６２０邋ＣＳＣｓ连续传代２５代。照片显示不同的时间（天）肿瘤球的形成情况。原放逡逑大倍数：２０0ｘ。Ｅ：邋ＰＣｓ邋和邋ＣＳＣｓ邋体外成球能力比较。将邋ＨＴ２９ＰＣｓ，ＳＷ６２０ＰＣｓ，ＨＴ２９ＣＳＣＳ逡逑和ＳＷ６２０邋ＣＳＣｓ分别以每孔５００、１００、２０、４个细胞接种在超低粘附９６孔板中，无血清培逡逑养７天。照片和柱状图显示肿瘤球的形成情况。原放大倍数：２００＞＜。逡逑

结肠癌细胞,细胞生存,杀伤力,活力

２４小时后检测细胞生存活力。ＮＣＭ４６０的ＩＣ５0值为３．１７７ｐＭ，明显逡逑高于结肠癌细胞的邋ＩＣ５０值（ＨＴ２９：邋１．８８邋ｐＭ，邋ＳＷ６２０：邋１．５６｜ａＭ，ＨＣＴ１１６：邋１．０９ｐＭ，逡逑ＬｏＶｏ：邋０．８７｜＿ｉＭ）（图３）。表明ＣＤ１３３－ＰＣ对结肠癌细胞更具杀伤力。逡逑１８逡逑

【参考文献】