新型邻位连接技术用于生物分子的高灵敏度检测研究

发布时间：2020-07-18 14:49

【摘要】：在癌细胞中,由于基因突变而异常高表达的蛋白常常分泌到血液中成为临床肿瘤检测的生物标志物,为癌症早期的诊断和治疗提供了依据。然而,这些标志物在肿瘤早期的含量往往是极低的,这就对准确的临床预测诊断造成了困难。邻位连接技术作为一种体外蛋白分析方法,由于其具有很高的检测灵敏度,因而近年来得到广泛应用。我们以免疫微球作为介质应用固相邻位连接技术(spPLA)检测前列腺特异性抗原(PSA),其最低检测限为0.1 pM,与免疫PCR相比,背景信号值更低实验重复性更好。并且将spPLA与环介导等温扩增技术(LAMP)相结合,能够检测到PSA的最低浓度为0.001 pM,是传统免疫检测的100倍。为了使实验操作更简便,同时避免因洗涤微球带来的实验误差,我们用戊二醛处理过的定量PCR管代替免疫微球,建立了一种以定量PCR管为固定相的更高效灵敏的蛋白检测方法。该方法整个检测过程都在定量PCR管中进行,洗涤方便,抗体固着稳定,对PSA和野生型p53的检测灵敏度为0.001 pM,并且能够达到7个数量级的检测范围。而且,我们将突变体p53特异性抗体PAb240包被在管壁上,应用管壁spPLA可以检测到血清中的突变体p53最低浓度为0.01 pM,其检测灵敏度大约是传统ELISA检测的500倍。管壁spPLA能够高效、灵敏检测血清中痕量蛋白,并且操作简单方便,有望成为癌症早期临床诊断的重要手段。由于小分子化合物自身结构的原因,两个抗体无法同时识别一个小分子,因此邻位连接技术(PLA)一直无法应用于小分子的高灵敏度检测。我们的研究将多个小分子化合物偶联到BSA上制成抗原,应用竞争免疫微球spPLA成功的检测了莱克多巴胺和克伦特罗两种“瘦肉精”小分子。其检测灵敏度达到了0.01 ng/ml,是传统免疫方法灵敏度的10-50倍,检测范围为7个数量级。与直接竞争法相比,间接竞争法将抗原直接包被于免疫微球上,能够大大的节省抗体的使用量,检测的线性范围更好。并且将莱克多巴胺小分子化合物稀释在不同的生物介质(尿液、血清和组织提取液)中,其检测灵敏度依然很高,检测范围不变。小分子化合物的检测常常出现交叉反应,影响检测结果的准确性,我们用莱克多巴胺的类似物进行交叉反应实验,其交叉反应率均小于0.01%。因此,我们实现了将核酸扩增的方法应用到小分子检测中。另外,本论文应用荧光共振能量转移技术(FRET)建立了一种新的快速、高效、具有高灵敏的检测FEN1和DNA2核酸酶活性的均相检测方法。该方法操作简单,避免了放射性元素的使用,应用该技术筛选FEN1和DNA2的新型抑制剂分子必将更加容易。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4

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本文编号：2761036