INPP4B介导激活SGK3促进NPM1突变白血病细胞存活的作用研究

发布时间：2020-07-19 05:34

【摘要】：目的:急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一组具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤。近一半的AML患者表现为染色体核型正常(normal karyotype AML,NK-AML)。已知多种基因突变与NK-AML的发生密切相关。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)突变是NK-AML中突变频率最高的基因之一,NPM1突变白血病已被2016年WHO白血病分型指南正式纳入为AML的一个独特亚型。然而,引起NPM1突变白血病恶性增殖的分子机制尚未完全阐明。II型磷脂酰肌醇4-磷酸酶(Inositol polyphospHate 4-phospHatase type II,INPP4B)是PI3K信号通路上的一种负调控因子,可通过抑制AKT的活化发挥抑癌作用。最近,来自白血病患者的临床研究发现,INPP4B在部分AML患者中高表达并表现出较差的存活率。然而,目前INPP4B在NPM1突变白血病细胞中的生物学作用及分子机制尚不清楚。因此,本研究旨在探讨INPP4B对NPM1突变白血病细胞恶性增殖的影响及其潜在分子机制,并进一步观察INPP4B对NPM1突变白血病患者临床预后的影响。方法:收集TCGA数据库中171位AML患者的RNA-seq数据并分析INPP4B的表达水平。采用qRT-PCR和western blot观察白血病细胞中INPP4B的mRNA和蛋白表达水平。采用CCK8和集落形成实验检测INPP4B表达对OCI-AML3细胞体外增殖的影响。通过western blot检测SGK3和AKT蛋白磷酸化水平的改变。此外,采用ELISA分析过表达INPP4B后白血病细胞中PI(3,4)P_2和PI(3)P水平的变化。通过siRNA和rescue实验观察SGK3在INPP4B介导的细胞增殖中的作用。观察干扰或过表达NPM1-mA(NPM1 type A mutation)后白血病细胞中INPP4B表达的改变。接着,观察干扰Ets-1或使用ERK抑制剂PD98059对OCI-AML3细胞INPP4B mRNA和蛋白水平的影响。最后,收集TCGA数据库中NPM1突变AML病例临床信息,采用Kaplan-Meier生存分析INPP4B表达对NPM1突变AML患者临床预后的影响。结果:首先,在NPM1突变白血病细胞中观察到INPP4B mRNA和蛋白高表达。干扰INPP4B能够抑制OCI-AML3细胞的体外增殖,而恢复INPP4B的表达可逆转这种抑制效应。其次,过表达INPP4B可上调OCI-AML3和THP-1细胞中SGK3的磷酸化(p-SGK3)水平,但不影响AKT的活化;反之亦然。接着,干扰SGK3可减弱OCI-AML3细胞的体外增殖能力,而rescue实验观察到恢复SGK3表达后能够逆转INPP4B下调导致的细胞生长抑制。此外,证实了NPM1-mA可通过ERK/Ets-1信号通路上调OCI-AML3中INPP4B的表达。同时,干扰NPM1-mA能够抑制OCI-AML3细胞的体外增殖,而回复INPP4B表达可逆转这种抑制效应。最后,Kaplan-Meier生存分析结果表明,高INPP4B组NPM1突变白血病样本总体生存率和三年无病生存率均显著降低。结论:INPP4B在NPM1突变白血病细胞中高表达并可促进其体外增殖,这可能与SGK3激活而非AKT有关。同时,NPM1-mA可通过ERK/Ets-1通路上调白血病细胞INPP4B的表达。此外,INPP4B高表达与NPM1突变白血病患者预后不良密切相关。深入研究INPP4B在NPM1突变白血病中的作用机制可能为临床该型白血病的诊治提供理论依据及潜在靶点。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.71
【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文0.0246，图 1-1B）。接着，在 5 种人髓系白血病细胞中检测 INPP4B 质的表达情况。结果显示，除了 HL60 和 KG1a 之外其余细胞株中均可P4B mRNA 的表达。值得注意的是，天然携带 NPM1 突变的 OCI-AMPP4B mRNA存在明显高表达（图1-1C）。同样地，OCI-AML3细胞中IN水平也存在高表达（图 1-1D）。以上结果表明，INPP4B 在 NPM1 突变现出相对较高的表达。

siINPP4B1和 siINPP4B2 组 INPP4B mRNA 水平较 Control 和 Mock 组显著下降（p < 0.05，图1-2A）。同时 western blot 结果显示，siINPP4B1 和 siINPP4B2 组 INPP4B 蛋白水平较对照组明显降低，其差异具有统计学意义（p < 0.05，图 1-2B）。以上结果提示，成功构建了干扰 INPP4B 的 OCI-AML3 白血病细胞株。图 1-2 构建干扰 INPP4B 的 OCI-AML3 细胞株Fig 1-2 The establishment OCI-AML3 cell lines with INPP4B knockdownA: qRT-PCR analysis of INPP4B expression from the OCI-AML3 cells transduced with the controlsiRNA or siINPP4B. B: western blotting analysis of INPP4B expression from the OCI-AML3 cellstransduced with the control siRNAor siINPP4B2.2.2 干扰 INPP4B 对白血病细胞体外增殖的影响为观察 INPP4B 对 NPM1 突变白血病细胞体外增殖的影响，通过 CCK8 实验检测干扰 INPP4B 后 OCI-AML3 细胞生长能力的改变。结果显示，与 Control 和 Mock组对比，siINPP4B1 和 siINPP4B2 组细胞生长能力显著下降（p < 0.05

图 1-3 干扰 INPP4B 对 OCI-AML3 细胞体外增殖的影响ig 1-3 The impact of INPP4B knockdown on cell proliferation in OCI-AML3 ceCK-8 assay analysis of cell proliferation activity in the siINPP4B transduced cells. BAML3 cells stably infected with shRNA lentivirus targeting INPP4B were subjected to ing assays. Rescue 实验证实 INPP4B 对白血病细胞的促增殖作用了进一步验证 INPP4B 对 OCI-AML3 细胞体外增殖的影响，我们设计了ue 实验。首先，采用靶向 INPP4B 的 shRNA 慢病毒载体感染 OCI-AML3 细功筛选出稳定下调 INPP4B 的细胞株（shINPPB-OCI-AML3）。接着，将EAK-Flag/INPP4B 质粒转入 shINPP4B-OCI-AML3 细胞，western blot 检测。结果显示，在 shINPP4B-OCI-AML3 细胞中过表达 INPP4B 后，INPP平较 shINPP4B 组得以恢复，差异具有统计学意义（p < 0.05，图 1-4A）。接

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