EZH2抑制剂GSK126促进骨髓来源抑制细胞（MDSC）产生进而促进肿瘤生长

发布时间：2020-07-22 21:25

【摘要】：研究背景:表观遗传组蛋白修饰在肿瘤发生以及在调控机体免疫系统上发挥着重要的作用。有研究表明在肿瘤发生及进展过程中常常会出现表观调控失常。值得注意的是,果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(EZH2)是表观遗传调控因子多属抑制复合体2的催化亚基,可以催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化并导致基因沉默。现有大量研究表明EZH2在肺癌,结肠癌,胰腺癌,前列腺癌等肿瘤中高表达,同时EZH2异常高表达也与临床不良预后成明显的相关性。更为重要的是,EZH2参与调控肿瘤细胞的生长与转移。因此抑制EZH2的活性可作为一个潜在的抗癌症治疗方式。到目前为止,已开发出多种高效并且特异性强的EZH2抑制剂,包括GSK126,EPZ-6438等,这两类药物已经进入到临床实验阶段中并用于治疗进展性的实体肿瘤以及B淋巴细胞瘤。肿瘤微环境中免疫细胞的浸润情况在一定程度上可以影响肿瘤的转归。大量的研究表明研究抗肿瘤药物对肿瘤微环境的影响可以更好地评估其抗肿瘤疗效,并开发出更有效的治疗策略。GSK126作为一种抗肿瘤的药物已经进入到临床实验阶段,然而其疗效仅仅在免疫缺陷的小鼠体内进行了证实,并没有考虑到药物对肿瘤微环境的影响。但是EZH2参与调控多种免疫细胞的生物学行为,EZH2抑制后可能会影响免疫细胞的功能从而改变其肿瘤免疫微环境状态。因此,我们推测EZH2抑制以后可能会降低免疫细胞的活性从而影响其抗肿瘤效应。基于此,探索EZH2抑制剂在免疫完全小鼠抗肿瘤效果以及其对肿瘤微环境中免疫细胞的影响可能会为临床上增强EZH2抑制剂的疗效提供理论基础。方法:1.研究GSK126在免疫完全以及免疫缺陷小鼠中的抗肿瘤疗效。1.1 C57BL/6小鼠皮下接种LLC,之后这些小鼠接受GSK126或者生理盐水注射治疗。1.2裸鼠皮下接种LLC,之后这些小鼠接受GSK126或者生理盐水注射治疗。1.3 C57BL/6小鼠皮下接种MC38,之后这些小鼠接受GSK126或者生理盐水注射治疗。1.4裸鼠皮下接种MC38,之后这些小鼠接受GSK126或者生理盐水注射治疗。2.研究GSK126对适应性免疫细胞的影响。2.1使用流式细胞术检测肿瘤组织中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。2.2使用流式细胞术检测肿瘤组织中Ki67~+细胞在CD4~+T细胞和CD8~+T细胞中的比例。2.3使用流式细胞术检测肿瘤组织中IFN-γ~+细胞在CD8~+T细胞中的比例。2.4使用流式细胞术检测肿瘤组织中Gzms-B~+细胞在CD8~+T细胞中的比例。2.5使用流式细胞术检测血液中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。2.6使用流式细胞术检测血液中IFN-γ~+细胞在CD8~+T细胞中的比例。2.7使用流式细胞术检测脾脏中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。2.8使用流式细胞术检测脾脏中IFN-γ~+细胞在CD8~+T细胞中的比例。3.研究GSK126能否通过改变肿瘤微环境从而抑制CD8~+T细胞的活性。3.1 C57BL/6小鼠皮下接种1X10~6MC38-OVA细胞。GSK126给予4天。7天后,使用磁珠分选出2 X10~6的OT1小鼠脾脏中的CD45.1~+CD8~+T细胞回输至荷瘤小鼠体内。3.2使用流式细胞术检测脾脏中CD45.1~+细胞在CD8~+T细胞中的比例。3.3使用流式细胞术检测脾脏中IFN-γ~+细胞在CD45.1~+CD8~+T细胞(初始CD8~+T细胞)中的比例(使用佛波醇酯+离子霉素或者OVA刺激)。3.4使用流式细胞术检测脾脏中IFN-γ~+细胞在CD45.1~+CD8~+T细胞(活化后的CD8~+T细胞)中的比例(使用佛波醇酯+离子霉素或者OVA刺激)。3.5研究GSK126治疗后哪一种免疫抑制细胞抑制了CD8~+T细胞的活性。3.6使用流式细胞术检测肿瘤组织中调节性T细胞的比例。3.7使用流式细胞术检测肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的比例。3.8使用流式细胞术检测肿瘤组织中树突状细胞的比例。4.使用流式细胞术检测肿瘤组织中骨髓来源抑制细胞(MDSC)的比例。4.1使用流式细胞术检测肿瘤组织中粒系来源MDSC和单核系来源MDSC的比例。4.2分选出control组以及GSK126处理组肿瘤组织中的MDSC,与CD8~+T细胞进行共培养,检测其对CD8~+T细胞增殖的抑制能力。4.3使用流式细胞术检测肿瘤组织中ROS~+细胞在MDSC中的比例。4.4使用荧光定量PCR检测control组以及GSK126处理组MDSC中Arg1和iNOS的表达情况。5.研究GSK126介导的MDSC增多是否影响了其抗肿瘤效应。5.1 C57BL/6小鼠皮下接种1X10~6LLC细胞,GSK126一周给与5次,Gr-1中和抗体一周给与两次。肿瘤体积每两天检测一次。5.2检测血液中Gr-1中和抗体清除MDSC的效率。5.3使用流式细胞术检测肿瘤组织中MDSC的比例。5.4使用流式细胞术检测肿瘤组织中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。5.5使用流式细胞术检测肿瘤组织中IFN-γ~+细胞在CD8~+T细胞中的比例。5.6使用Tunel法检测肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡情况。6.研究吉西他滨/5FU的与GSK126的联合治疗策略是否可以提高GSK126的抗肿瘤效果。6.1 C57BL/6小鼠皮下接种1X10~6LLC细胞,GSK126一周给与5次吉西他滨/5FU一周给与一次。肿瘤体积每两天检测一次。6.2使用流式细胞术检测肿瘤组织中MDSC的比例。6.3使用流式细胞术检测肿瘤组织中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。7.研究GSK126促进MDSC增多的原因。7.1使用Brdu法检测MDSC的增殖能力。7.2使用流式细胞术检测骨髓,血液和脾脏中MDSC的比例。7.3使用qPCR和蛋白印迹实验检测HPC,MDSC和巨噬细胞中EZH2的表达。7.4使用免疫印迹法检测GSK126处理后H3k27me3的表达情况。7.5使用流式细胞术检测GSK126处理后,HPC往MDSC的分化能力。结果:1.GSK126并不能有效抑制免疫功能完全的荷瘤小鼠肿瘤的生长。1.1在LLC皮下移植瘤模型当中,GSK126能够明显抑制免疫缺陷小鼠体内肿瘤的生长。1.2在LLC皮下移植瘤模型当中,GSK126不能抑制免疫功能完全小鼠体内肿瘤的生长。1.3在MC38皮下移植瘤模型当中,GSK126能够明显抑制免疫缺陷小鼠体内肿瘤的生长。1.4在MC38皮下移植瘤模型当中,GSK126不能抑制免疫功能完全小鼠体内肿瘤的生长。2.GSK126减弱了抗肿瘤适应性免疫应答。2.1使用GSK126能够减少肿瘤组织中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。2.2使用GSK126能够减少肿瘤组织中CD8~+T细胞中的Ki67~+细胞的比例。2.3使用GSK126能够减少肿瘤组织中CD8~+T细胞中的IFN-γ~+细胞的比例。2.4使用GSK126不会改变肿瘤组织中CD8~+T细胞中的Gzms-B~+细胞的比例。2.5使用GSK126能够减少血液中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。2.6使用GSK126能够减少血液中CD8~+T细胞中的IFN-γ~+细胞的比例。2.7使用GSK126能够减少脾脏中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。2.8使用GSK126能够减少脾脏中CD8~+T细胞中的IFN-γ~+细胞的比例。3.GSK126通过重塑肿瘤微环境进而影响CD8~+T细胞的数量与功能。3.1使用GSK126能够减少CD8~+T细胞中的CD45.1~+细胞的比例。3.2使用GSK126能够减少CD45.1~+CD8~+T细胞中(初始T细胞)的IFN-γ~+细胞的比例。3.3使用GSK126能够减少CD45.1~+CD8~+T细胞中(活化T细胞)的IFN-γ~+细胞的比例。4.GSK126促进肿瘤组织中MDSC的扩增。4.1使用GSK126不会影响调节性T细胞。4.2使用GSK126不会影响肿瘤相关巨噬细胞。4.3使用GSK126不会影响树突状细胞。4.4 GSK126能够显著增加肿瘤组织中MDSC的比例。4.5 GSK126能够显著增加粒系来源的MDSC以及单核系来源MDSC的比例。4.6经GSK126治疗后的荷瘤小鼠肿瘤组织中的MDSC,相较于对照组肿瘤组织中的MDSC,都具有相同的对T细胞的抑制能力。4.7 GSK126治疗后并不会改变MDSC上ROS,Arg1,iNOS等效应分子的表达。5.清除MDSC后能够恢复GSK126的抗肿瘤效应。5.1 MDSC清除后能够肿瘤体积明显缩小。5.2注射Gr-1清除抗体能够有效地清除血液中的MDSC。5.3注射Gr-1清除抗体能够显著减少肿瘤组织中的MDSC比例。5.4注射Gr-1清除抗体能够显著增加肿瘤组织中的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例。5.5注射Gr-1清除抗体能够显著增加肿瘤组织中CD8~+T细胞中的IFN-γ~+细胞的比例。5.6联合使用GSK126和Gr-1中和抗体能够增加肿瘤细胞的凋亡。6.临床化疗药物能够提高GSK126的抗肿瘤效应。6.1吉西他滨或5Fu能够显著提高GSK126的抗肿瘤效果。6.2在联合治疗组中,肿瘤组织中的MDSC比例明显下降。6.3在联合治疗组中,肿瘤组织中的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例明显增加。7.GSK126促进造血前体细胞分化为MDSC7.1 GSK126不能促进MDSC的增殖。7.2 GSK126不会改变肿瘤组织中趋化因子的表达。7.3 GSK126能够明显增加骨髓,血液,脾脏组织中MDSC的比例。7.4 EZH2在造血前体细胞上是高表达的,在MDSC和巨噬细胞上是低表达的。7.5 GSK126能够降低造血前体细胞上H3k27me3的表达水平。7.6 GSK126能够促进造血前体细胞分化为MDSC。结论:GSK126介导的EZH2抑制能够促进造血前体细胞分化为MDSC,从而导致肿瘤组织中MDSC增加,抑制抗肿瘤免疫应答。更重要的是,使用Gr-1清除抗体或者吉西他滨/5Fu能够有效提高GSK126的抗肿瘤效应。从机制上来讲,GSK126治疗疗效不佳是由增多的MDSC所导致的,有效地清除MDSC是发挥GSK126抗肿瘤效应的关键所在。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2
【图文】：

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陆军军医大学博士学位论文/6 荷瘤小鼠进行了 GSK126 的注射，注射剂量为 150mg/kg。然而 C57B受了 GSK126 治疗并不能有效地抑制 LLC 肿瘤生长。说明 GSK126 在免体内并没有充分发挥其抗肿瘤效应（图 1）。

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陆军军医大学博士学位论文.3.2 GSK126 并不能有效抑制免疫功能完全的 MC38 荷瘤小鼠肿瘤的生长了进一步验证此现象具有普遍性，我们选用了 GSK126 药物敏感性相似的C38 进行了相同的实验。我们发现 GSK126 能够明显抑制免疫缺陷小鼠 M长。然而 C57BL/6 荷瘤小鼠接受了 GSK126 治疗并不能有效地抑制 MC38 2）。

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24图 3 （A）WB 检测 GSK126 处理后 LLC 细胞 EZH2,H3K27me3 的表达。（B）流式细胞术检测 GSK126 处理后 LLC 细胞 EZH2,H3K27me3 的表达。（C）WB 检测 GSK126 处理后 MC38 细胞EZH2,H3K27me3 的表达。（D）流式细胞术检测 GSK126 处理后 MC38 细胞 EZH2,H3K27me3 的表达。（E）WB 检测 GSK126 处理后 LLC 肿瘤 EZH2,H3K27me3 的表达。（F）流式细胞术检测 GSK12处理后 LLC 肿瘤 EZH2,H3K27me3 的表达。（G）WB 检测 GSK126 处理后 MC38 肿瘤EZH2,H3K27me3 的表达。（H）流式细胞术检测 GSK126 处理后 MC38 肿瘤 EZH2,H3K27me3 的表达。使用非配对 T 检验检测统计学差异。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

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