具有肿瘤靶向的刺激响应型聚合物胶束在癌症治疗中的研究

发布时间：2017-03-30 14:12

  本文关键词：具有肿瘤靶向的刺激响应型聚合物胶束在癌症治疗中的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：癌症已然成为严重威胁人类生命的一大杀手,化疗是目前治疗癌症的主要手段,然而化疗药物普遍存在着水溶性差、毒副作用大、生物利用度低等缺点。针对这些弊端,基于纳米载体的药物传递系统(DDS)的研究应运而生。其中,聚合物胶束作为一种最常见的DDS的形式,对难溶性化疗药物具有很好的的增溶作用,并且可实现药物的靶向传递及控制释放。本论文旨在构建同时具有肿瘤靶向性及刺激响应性的聚合物胶束,对其进行了性能表征、体内外肿瘤靶向及治疗评价。在论文第二章,我们通过开环聚合反应成功合成了温度敏感的Pluronic F127-聚D,L-丙交酯(F127-PLA,缩写为FP)共聚物。通过溶剂挥发法制备胶束,胶束的LC、EE、粒径、LCST、不透明温度和沉淀温度随着PLA链段的增长而增大或升高；胶束的CMC随着PLA链段的增长而减小。酸性和高温都能加快药物从胶束中的释放,然而只有LCST在37℃与40℃之间的FP100胶束具备体温下维持稳定,高温下快速释放药物的理想释药特性。因此,我们选择FP100胶束修饰叶酸用于细胞实验的研究,FA-FP100胶束具有与FP100胶束近乎一致的粒径、形貌、温敏转变性质及释药曲线。细胞吞噬实验表明FA-FP100胶束能选择性的的被FR过表达的HeLa细胞吞噬,而低表达FR的A549细胞吞噬FP100及FA-FP100胶束的量很少。活死细胞染色和Alamar blue法证实FP100与FA-FP100至白胶束具有良好子的细胞相容性,在浓度达到1000μg/mL的情况下3T3细胞与HeLa细胞仍然具有90%以上的存活率；40℃的高温显著增加了两种载药胶束对HeLa细胞的毒性。Annexin V-FITC/PI对经药物处理的细胞染色后,FACS分析细胞凋亡情况得知,载药胶束在40℃C比在37℃更多的诱导HeLa细胞凋亡。在论文第三章,我们将叶酸分子修饰在PEG-PCL的亲水端,DOX通过酸不稳定的腙键连接到疏水端,成功合成了一种具有叶酸靶向及pH敏感的键合药物FA-hyd。通过溶剂挥发法制得粒径在70 nm左右、呈球形分布的胶束。FA-hyd在pH 5.0腙键断裂,胶束粒径增大,药物释放速率加快,而在中性条件下能够保持稳定。溶血率、凝血时间、细胞毒性的数据证实FA-PECL空自胶束具有良好的生物相容性。细胞吞噬及细胞毒性结果显示,FA-hyd胶束能够特异性识别并杀死FR过表达的KB细胞。药物体内分布表明,FA-hyd胶束显著增加了药物在肿瘤部位的聚集并减少在正常组织的的浓度。药代动力学参数显示FA-hyd胶束的AUC是所有组中最大的,CL、Vd是所有组中最小的,τ1/2β也仅次于FA-cbm胶束,充分说明FA-hyd增加了药物在血液中的循环时间。给予建立有4T1肿瘤模型的Balb/c小鼠连续治疗后,FA-hyd胶束组肿瘤体积增长最慢,小鼠体重几乎没有变化,存活时间最长,表明这种叶酸靶向及pH敏感的键合药物胶束具有最佳的抗肿瘤效果及最高的安全性。治疗末期取出小鼠肿瘤,HE染色显示FA-hyd胶束组的凋亡特征最为明显,进一步从组织学水平证实了其药效。在论文第四章,我们成功合成了叶酸靶向及pH/还原双敏感mPEG-PLA-ss-PEI/FA-DMMA(PELE/FA-DA),MS软件模拟了PEI与FA的反应过程,证实了FA更有可能修饰在PEI的末端伯胺上,因此更有利于暴露在胶束外壳以识别FR,模拟结果与实验表征高度吻合。PELE/FA-DA胶束有效阻止BSA吸附,因此在血液中具有很好的稳定性。PELE/FA-DA在pH 6.8酰胺键断裂,胶束粒径增大,表面电荷由负电荷反转为正电荷,中性条件下则稳定存在；在10mM GSH作用下二硫键发生断裂,PEI从胶束表面脱落,粒径增大,胶束发生解体。TEM图像显示,PELE/FA-DA胶束在pH 5.0及10 mM GSH作用下,胶束结构遭到破坏,迅速发生聚集。在酸性和还原性条件下DOX从胶束中的释放速率远远快于在中性或未加入还原剂的环境。PELE/FA-DA胶束在pH 6.8比在pH 7.4具有更高的细胞内在化率及细胞毒性。药物体内分布显示,PELE/FA-DA胶束显著增加了药物在肿瘤的聚集并减少在正常组织的浓度。药代动力学参数表明PELE/FA-DA胶束的AUC是所有组中最大的,CL, Vd是所有组中最小的,τ1/2β也是最长的,说明PELE/FA-DA胶束明显增加了药物在血液中的循环时间。给予建立有4T1肿瘤模型的Balb/c、鼠连续治疗后,PELE/FA-DA载药胶束组肿瘤体积增长最慢,小鼠体重略微增加,存活时间最长,表明这种叶酸靶向及pHH/还原双敏感的胶束具有最佳的抗肿瘤效果及最高的安全性。治疗末期取出小鼠肿瘤,同样也是PELE/FA-DA载药胶束组肿瘤抑制率最高,HE染色和TUNEL染色显示该组的肿瘤细胞数量最少、凋亡特征最明显，凋亡率也最高,进一步从组织学水平证实了其药效。论文最后一章是在第四章的基础上,通过调节聚合物之间的比例,设计了能够实现细胞核靶向的聚合物胶束。同样以mPEG-PLA-ss-PEI-DMMA (PELESS-DA)作为材料骨架,与第四章不同之处在于mPEG与PLA的分子量及比例不同,我们筛选出mPEG5000-PLA4000这一嵌段共聚物,由此形成的胶束PELA具有可自由穿透核孔的尺寸。将mPEG5000-PLA4000进一步与PEI、DMMA反应合成pH/还原双敏感的聚合物PELEss-DA。通过溶剂挥发法制备胶束,粒径在40 nnl左右,LC和EE分别超过10%和70%。随着环境pH值降低,胶束zeta电位从负电荷反转为正电荷,粒径也逐渐增大；10 mM GSH作用下胶束粒径又逐渐减小,2小时后变得与PELA胶束一样大小。PELESS-DA经10 mM GSH作用后二硫键断裂,PEI壳层从胶束表面脱落。胶束在酸性条件下释放DOX速率相对在中性条件下较快。PELEss-DA胶束在pH 6.8比在pH 7.4能更快的被MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞摄取,并且能够携载DOX进入细胞核,此外载药胶束在酸性条件下细胞毒性更大。Annexin V-FITC/PI对经药物处理的细胞染色后,FACS分析细胞凋亡情况得知,PELEss-DA载药胶束在酸性条件下比其它各组更多的诱导MCF-7/ADR细胞凋亡。肿瘤冰冻组织切片的CLSM图像显示PELEss-DA载药胶束在MCF-7/ADR肿瘤的分布量远远大于其它各组,并且大部分定位于细胞核。给予建立有MCF-7/ADR肿瘤模型的Balb/c裸鼠连续治疗后,PELEss-DA载药胶束组肿瘤体积增长最慢,裸鼠体重略微增加,存活时间最长,说明这种核靶向及pH/还原双敏感的胶束具有最佳的抗肿瘤效果及最高的安全性。治疗末期取出裸鼠肿瘤,HE染色和TUNEL染色显示该组的肿瘤细胞核皱缩、破碎,凋亡特征最明显,从组织学水平证实了其药效。Western blot从蛋白水平显示PELEss-DA载药胶束能够上调肿瘤促凋亡蛋白Caspase-3的表达并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,RT-PCR进一步从基因水平证实PELEss-DA载药胶束能够上调肿瘤Caspase-3基因的表达并下调Bcl-2基因的表达。
【关键词】：肿瘤靶向 刺激响应 药物传递 聚合物胶束 癌症治疗
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.1
【目录】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 常用缩略词一览表15-22
• 第1章 绪论22-54
• 1.1 引言22
• 1.2 纳米载体的靶向性22-28
• 1.2.1 被动靶向23-25
• 1.2.2 主动靶向25-28
• 1.3 刺激响应型纳米载体28-43
• 1.3.1 温度响应29-33
• 1.3.2 pH响应33-36
• 1.3.3 还原响应36-39
• 1.3.4 其它响应39-40
• 1.3.5 双重或多重响应40-43
• 1.4 聚合物胶束43-49
• 1.4.1 聚合物胶束概述43-44
• 1.4.2 聚合物胶束：优点以及缺点44-45
• 1.4.3 聚合物胶束内核研究45-47
• 1.4.4 聚合物胶束外壳研究47-48
• 1.4.5 多功能聚合物胶束48-49
• 1.5 本论文研究目的、研究内容及创新49-54
• 1.5.1 本论文研究目的49
• 1.5.2 本论文研究内容49-52
• 1.5.3 本论文主要创新点52-54
• 第2章 叶酸靶向及温度敏感型聚合物胶束的研究54-84
• 2.1 引言54-55
• 2.2 实验材料与仪器55-56
• 2.2.1 实验材料55-56
• 2.2.2 实验细胞56
• 2.2.3 实验仪器56
• 2.3 实验方法56-63
• 2.3.1 叶酸靶向及温度敏感型共聚物的合成56-58
• 2.3.2 共聚物的表征58
• 2.3.3 胶束的制备与表征58-61
• 2.3.4 细胞吞噬和亚细胞定位61-62
• 2.3.5 体外细胞毒性62-63
• 2.3.6 统计学分析63
• 2.4 结果与讨论63-83
• 2.4.1 共聚物的合成与表征63-67
• 2.4.2 胶束的制备与表征67-68
• 2.4.3 温敏性考察68-70
• 2.4.4 体外药物释放70-72
• 2.4.5 FA-FP100的表征72-76
• 2.4.6 细胞吞噬和亚细胞定位76-78
• 2.4.7 细胞相容性评价78-79
• 2.4.8 温度对细胞毒性的影响79-82
• 2.4.9 温度对细胞凋亡的影响82-83
• 2.5 本章小结83-84
• 第3章 叶酸靶向及pH敏感型键合药物胶束的研究84-117
• 3.1 引言84-85
• 3.2 实验材料与仪器85-86
• 3.2.1 实验材料85
• 3.2.2 实验细胞和动物85-86
• 3.2.3 实验仪器86
• 3.3 实验方法86-94
• 3.3.1 叶酸靶向及pH敏感型键合药物的合成86-88
• 3.3.2 共聚物的表征88-89
• 3.3.3 胶束的制备与表征89-90
• 3.3.4 生物相容性评价90-91
• 3.3.5 细胞吞噬和亚细胞定位91-92
• 3.3.6 体外细胞毒性92
• 3.3.7 动物肿瘤模型的建立及实验方法92
• 3.3.8 药物体内分布92-94
• 3.3.9 体内抗肿瘤活性研究94
• 3.3.10 统计学分析94
• 3.4 结果与讨论94-115
• 3.4.1 键合药物的合成与表征94-100
• 3.4.2 胶束的制备与表征100-102
• 3.4.3 pH敏感性考察102-104
• 3.4.4 体外药物释放104-105
• 3.4.5 生物相容性评价105-106
• 3.4.6 细胞吞噬和亚细胞定位106-109
• 3.4.7 体外细胞毒性109
• 3.4.8 药物体内分布109-112
• 3.4.9 体内抗肿瘤活性112-115
• 3.5 本章小结115-117
• 第4章 叶酸勒向及pH/还原双敏感型聚合物胶束的研究117-164
• 4.1 引言117-119
• 4.2 实验材料与仪器119-120
• 4.2.1 实验材料119
• 4.2.2 实验细胞和动物119
• 4.2.3 实验仪器119-120
• 4.3 实验方法120-130
• 4.3.1 叶酸靶向及pH/还原双敏感型共聚物的合成120-122
• 4.3.2 共聚物的表征122
• 4.3.3 胶束的制备与表征122-125
• 4.3.4 细胞表面叶酸受体(FR)表达125
• 4.3.5 细胞吞噬和亚细胞定位125-126
• 4.3.6 体外细胞毒性126-127
• 4.3.7 动物肿瘤模型的建立及实验方法127-128
• 4.3.8 药物体内分布128-129
• 4.3.9 体内抗肿瘤活性研究129
• 4.3.10 统计学分析129-130
• 4.4 结果与讨论130-163
• 4.4.1 共聚物的合成与表征130-137
• 4.4.2 胶束的制备与表征137-138
• 4.4.3 蛋白吸附表征138
• 4.4.4 pH/还原双敏感性考察138-144
• 4.4.5 体外药物释放144-146
• 4.4.6 细胞表面FR表达146-147
• 4.4.7 细胞吞噬和亚细胞定位147-153
• 4.4.8 细胞相容性评价153-155
• 4.4.9 pH对细胞毒性的影响155-157
• 4.4.10 药物体内分布157-160
• 4.4.11 体内抗肿瘤活性160-163
• 4.5 本章小结163-164
• 第5章 核鞭向及pH/还原双敏感型聚合物胶束的研究164-198
• 5.1 引言164-165
• 5.2 实验材料与仪器165-167
• 5.2.1 实验材料165-166
• 5.2.2 实验细胞和动物166
• 5.2.3 实验仪器166-167
• 5.3 实验方法167-175
• 5.3.1 核靶向及pH/还原双敏感型共聚物的合成167-168
• 5.3.2 共聚物的表征168-169
• 5.3.3 胶束的制备与表征169-170
• 5.3.4 细胞吞噬和亚细胞定位170-171
• 5.3.5 体外细胞毒性171-172
• 5.3.6 动物肿瘤模型的建立及实验方法172
• 5.3.7 药物肿瘤组织分布172-173
• 5.3.8 体内抗肿瘤活性173-174
• 5.3.9 统计学分析174-175
• 5.4 结果与讨论175-196
• 5.4.1 共聚物的合成与表征175-178
• 5.4.2 胶束的制备与表征178-179
• 5.4.3 pH/还原双敏感性考察179-183
• 5.4.4 体外药物释放183-184
• 5.4.5 细胞吞噬和亚细胞定位184-186
• 5.4.6 细胞相容性评价186-188
• 5.4.7 pH对细胞毒性的影响188-189
• 5.4.8 pH对细胞凋亡的影响189-191
• 5.4.9 药物肿瘤组织分布191-192
• 5.4.10 体内抗肿瘤活性192-196
• 5.5 本章小结196-198
• 结论与展望198-200
• 致谢200-202
• 参考文献202-231
• 攻读博士学位期间发表的论文及科研成果231-23

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