HBx-shRNA和h-CCL20影响HepG2.2.15细胞的实验研究

发布时间：2020-07-28 18:55

【摘要】：研究目的通过构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体和pHBLV-h-CCL20载体,转染入HepG2.2.15细胞,研究HBx沉默和h-CCL20过表达对HepG2.2.15细胞生长的影响,以期阐明两种基因参与肝脏恶性肿瘤发生发展的分子机制。研究方法(1)构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体,通过电穿孔法转染HepG2.2.15细胞。(2)通过实时荧光定量PCR检测HBx、h-CCL20基因表达量差异;CCK8法检测细胞增殖活力;对各组细胞上清液中HBsAg和HBeAg进行检测;运用流式术对HepG2.2.15细胞的凋亡进行检测。(3)构建pHBLV-h-CCL20载体并转染HepG2.2.15细胞,在荧光显微镜下观察到有明显的绿色荧光,表明pHBLV-h-CCL20载体转染HepG2.2.15细胞成功。研究结果(1)成功构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体和pHBLV-h-CCL20载体,且在HepG2.2.15细胞中能够成功的表达。(2)从实时荧光定量PCR结果知,已经成功转染了pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体的HepG2.2.15细胞HBx基因的表达与转染空载体的HepG2.2.15细胞相比下降了28%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05),从而说明shRNA对HBx基因的表达起到了抑制的作用。(3)用CCK-8法检测细胞增殖情况表明,HepG2.2.15细胞的增殖水平明显的受shRNA的抑制,细胞增殖水平下降了47%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。(4)转染pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达量下降明显,HepG2.2.15细胞的凋亡明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P0.01),因此表明HBx基因在细胞凋亡过程中发挥作用。(5)pHBLV-h-CCL20载体在HepG2.2.15细胞中h-CCL20基因过表达,h-CCL20基因过表达在HepG2.2.15细胞凋亡过程中发挥促进作用。结论(1)利用RNAi技术,应用电穿孔法转染细胞,在HepG2.2.15细胞中,抑制HBx基因的表达,使上清液中HBsAg和HBeAg的表达量下降;对HepG2.2.15细胞的增殖起到抑制作用,促进细胞的凋亡。(2)pHBLV-h-CCL20载体在HepG2.2.15细胞中h-CCL20基因过表达,h-CCL20基因过表达在HepG2.2.15细胞凋亡过程中发挥促进作用,为h-CCL20基因的研究提供理论基础。
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

海南医学院硕士学位论文⑤把适量培养基加进去，然后轻轻小心充分吹打散细胞，加入适量细胞冻存液，混匀。随后分装到冻存管中，并且标好相应的信息。将冻存管放于冰箱中（4°C2 小时，-20°C 2 小时，-80°C 24 小时），最后放到液氮长期保存。1.2.2 构建 pGenesil-3.1-HBx-shRNA 重组表达载体（1）设计引物及连接根据相关文献[38]引物结构，设计序列如下。引物结构：BamHI +Sense+Loop+Antisense+终止信号+ SalI + HindIII。

功构建 pGenesil-3.1-HBx-shRNA 重组表达载体得到线性化的 pGenesil-3.1 质粒根据 pGenesil-3.1 质粒载体图谱可知，在 U6 启动子下存在两个酶切是 Hind III 和 BamH I。为了得到所要的线性化 pGenesil-3.1 质粒，可 III 和 BamH I 酶切，但是查阅相关文献发现这两种内切酶所用的反，Hind III 酶切体系为（10×M Buffer 2μL +pGenesil-3.1 质粒 17μL+），先用 Hind III 进行酶切，然后回收，接着再用 BamH I 进行酶切体系为（10×K Buffer 2μL +pGenesil-3.1 质粒 17μL+BamH I 1μL产物就是所要的线性化 pGenesil-3.1 质粒。①据反应条件，首先用 Hind III 酶切，酶切体系为：10×M Buenesil-3.1 质粒 17μL+Hind III 1μL。所得结果如下图 1 所示，其5000；A、C：为经 Hind III 单酶切的质粒；B：为未酶切质粒。

I 酶切体系为（10×K Buffer 2μL +pGenesil-3.1 质粒 17μL+BamH 回收产物就是所要的线性化 pGenesil-3.1 质粒。①据反应条件，首先用 Hind III 酶切，酶切体系为：10×L+pGenesil-3.1 质粒 17μL+Hind III 1μL。所得结果如下图 1 所示DL 15000；A、C：为经 Hind III 单酶切的质粒；B：为未酶切质粒图 1 pGenesil-3.1 质粒 Hind III 酶切②将 pGenesil-3.1 质粒 Hind III 酶切后，把大片段回收，然后是对的。所得结果如下图 2 所示，其中 M1：10μL DL 15000；A产物；M2：15μL DL 15000。

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