RNA结合蛋白ASS1和CSRP1在肺癌中的功能和机制研究

发布时间：2020-07-30 08:04

【摘要】：肺癌是全世界范围内癌症相关死亡的主要原因,在我国肺癌的发生率和致死率居高不下,五年生存率仍然非常低。然而肺癌发生发展所涉及的复杂的分子机制尚未完全阐明,因此探索肺癌的发生、发展机制尤其重要。研究发现许多RNA结合蛋白与肿瘤的发生发展具有密切关系,本文旨在研究RNA结合蛋白ASS1和CSRP1对人肺癌细胞增殖和迁移侵袭潜能的影响及其可能作用机制。我们分别构建了稳定过表达或稳定敲减ASS1和CSRP1肺癌稳转细胞系。首先通过实时荧光定量PCR及蛋白质印记法检测ASS1和CSRP1 mRNA及蛋白在肺癌细胞中的表达水平。然后通过CCK-8法、Transwell迁移侵袭实验和细胞划痕实验,我们发现ASS1过表达可抑制肺癌细胞的迁移侵袭能力而对肺癌细胞的增殖能力无明显影响;CSRP1过表达可促进肺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力。在各自的分子机制研究方面,我们发现ASS1可以参与MAPK通路的调控;CSRP1参与调控p-FAK信号转导通路。此外通过蛋白质免疫共沉淀实验,我们发现ASS1可与促癌基因CPS1结合,并调控后者表达水平。综上所述,我们揭示了RNA结合蛋白ASS1以及CSRP1在肺癌增殖和侵袭迁移中的作用以及可能的分子机制。这些发现为寻找肺癌新的治疗靶点提供了新的线索。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

25 ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，培养 96h 后，CCK8 法检测细胞活力。统计学方法采用 SPSS 13.0 和 GraphPad Prism 5 软件对实验数据进行统计学分析。组间差异分析采用 t 检验（two-tailed，P <0.05 为差异具有统计学意义）。2 结果2.1 肺癌 低转移细胞系 mRNA 表达谱芯 结果的验证在我们实验室的前期工作中，我们对 SPC-A-1 和 SPC-A-1sci 细胞进行了两次 mRNA 表达谱芯片分析，我们从中挑选了 10 个转移相关的基因进行 mRNA水平验证，图 1-1 显示验证结果基本与芯片结果一致，由此证实了我们芯片结果的可靠性。

第一部分 ASS1 抑制肺癌细胞迁移和侵袭能力及cells compared with the SPC-A-1 cells. ASS1 = argininosuccinate synthase 12.2 3 个候选基因在肺癌细胞系中的功能验证接下来我们挑选了 ASS1， ALDH2，MSLN 这三个基因进行初步实验。首先我们在 mRNA 表达水平较高的 SPC-A-1 细胞中通过 si-RN染的方法，敲低这三个基因的表达水平，mRNA 表达水平的质控如图 1-2转染有效。Transwell 迁移实验（图 1-2B）显示敲减 ASS1 之后，SPC-的迁移潜能明显增强，而敲减 ALDH2 和 MSLN 之后，SPC-A-1 细胞的并未发生明显改变。A

after transfecting with si-ASS1/si-ALDH2/ si-MSLN or si-NC in SPC-A-1 cell line, β-actin was used as the loading control. (B)The migration ability of SPC-A-1 cells wasdetected by Transwell assays. The left panels show photos of representative fields(magnification: 100×) of migration cells and the right panel shows histograms of theresults. Student’s t-test was used for Statistical analysis.2.3 重组慢病毒感染后 ASS1 的过表达和干扰效果检测根据 2.1.1 qRT-PCR 结果显示，ASS1 在 SPC-A-1sci 中表达水平较低，而在SPC-A-1 中表达水平较高，因此我们选择在 SPC-1-1sci 中稳定过表达 ASS1，并在 SPC-A-1 中稳定干扰 ASS1.qRT-PCR 实验和 WesternBlot 实验分别检测过表达效率以及干扰效率检测，结果如图 1-3 所示。A B

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