KLF9在胃癌转移中的作用及分子机制

发布时间：2020-07-30 08:24

【摘要】：胃癌是一种严重威胁人类健康的恶性疾病,在中国有着较高的发病率。最新的研究统计显示,胃癌在中国的发生率和死亡率在各类肿瘤中均排名第2位。导致胃癌治疗效果和预后不佳的原因主要是早期诊断的匮乏,患者出现明显症状时,大多已经处于进展期,甚至已经发生远端转移。发生远端转移的胃癌病人预后很差,其5年生存率仅为5%。然而,胃癌发生转移的过程中涉及的分子调控机理尚不清楚。因此,积极探索胃癌早期诊断方法和深入研究胃癌转移的相关分子机制对于治疗胃癌具有重要的临床意义。转录因子在几乎所有的生物学过程中起着主导作用,包括细胞增殖、分裂、迁移和凋亡等。研究表明,转录因子网络的异常调控在许多癌症的发生发展过程中占据核心位置。Kruppel样因子(Kruppel-likefactor,KLF)是一类羧基端具有3个高度保守的C2H2类型锌指结构的核转录因子家族,该家族包括17个成员,他们广泛表达于各种组织,调控着多种生物学过程。许多研究表明KLF的异常调节与多种疾病相关,包括心血管疾病、代谢异常和癌症等。在最初研究中,KLF9因其能够特异地结合基本转录元件(Basic transcription element,BTE),所以被称作基本转录元件结合蛋白(Basic transcription element binding protein,BTEB)。敲除KLF9基因的小鼠能够正常生长和繁殖,且与野生型小鼠在外形上无明显差异。但是,KLF9基因敲除的雌性小鼠的生殖系统在结构和功能上均有异常,表现为胚胎着床数目和产仔数目下降,以及新生幼鼠死亡率增加。最近的一系列研究表明KLF9在人类结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌中扮演着抑癌因子的角色。然而,目前关于KLF9是否参与胃癌的发生发展或转移等过程还了解甚少。为了深入研究胃癌转移过程的分子调控机制,我们以癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库为基础,通过单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)将TCGA数据库中的胃癌病人分成高转移风险和低转移风险两个类群,然后对这两个类群进行差异基因分析,从而确定了 1770个潜在的胃癌转移相关基因。研究显示,转录因子在癌症转移过程中具有核心调控作用,所以我们主要针对具有差异表达的转录因子进行进一步的筛选研究。经过在其他四个胃癌芯片数据中的进一步验证,最终确认了 5个潜在的胃癌转移相关转录因子,KLF9就是其中之一。我们的生物信息学分析提示KLF9可能在胃癌转移过程中起着重要作用。为了进一步了解KLF9在胃癌转移过程中的作用,我们分析了在发生远端转移病人的胃癌组织样本中KLF9的表达情况,结果显示KLF9在已发生远端转移病人的胃癌组织样本中表达量显著低于与其年龄、性别及病理信息均配对的未发生远端转移病人,提示KLF9可能扮演了胃癌转移抑制因子的角色。进一步的基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)也提示了与癌症转移相关的多个基因集均明显富集于KLF9相对低表达的胃癌病人群体。为了探究KLF9对胃癌细胞的具体影响,我们在多个胃癌细胞系中过表达KLF9或利用RNA干扰下调KLF9表达水平,观察其细胞生物学表型。结果表明,下调KLF9对胃癌细胞的增殖及克隆形成能力没有显著影响,但是能够显著提升其迁移和侵袭能力。相反,过表达KLF9会显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。这些结果提示,KLF9能够抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力,但是不影响其增殖和克隆形成能力。进一步,我们通过尾静脉注射的方法探究KLF9对胃癌细胞在小鼠体内的肺转移能力的影响。结果显示,与对照组相比,稳定过表达KLF9的胃癌细胞在小鼠体内的肺转移能力显著下降,进一步表明了 KLF9是胃癌转移过程中的抑制因子。由于KLF9在胃癌转移过程中发挥抑制因子的功能,我们希望进一步探究KLF9调控胃癌转移的分子机制。转录因子是一类能够结合目的基因5'上游特定序列从而保证其在特定时间和空间表达的蛋白分子。为了确定KLF9调控的靶基因,我们分析了现有的KLF9染色质免疫沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)数据。通过系统的分析,我们确定了 823个潜在的KLF9靶基因。接下来,我们从这些潜在的靶基因中筛选出已有文献报导与癌症转移相关的基因作为主要研究对象,探究其在过表达KLF9的胃癌细胞系中的表达情况。检测结果显示,金属机制蛋白酶家族成员28(Matrix metalloproteinase 28,MMP28)的mRNA和蛋白水平在KLF9过表达的胃癌细胞中明显下降。进一步的双荧光素酶报告基因实验证实了 KLF9在MMP28启动子区域有着特异性结合。以上结果提示,在胃癌细胞中,KLF9能够特定地抑制MMP28的mRNA表达,进而降低MMP28的蛋白水平。为了进一步确认KLF9通过介导MMP28的转录沉默来抑制胃癌的转移,我们进行了挽救实验。结果表明,在KLF9过表达的胃癌细胞中进一步过表达MMP28使其蛋白水平恢复至对照组水平,能够部分挽救由KLF9过表达所导致的胃癌细胞侵袭能力下降的表型。通过进一步的小鼠尾静脉检测胃癌细胞肺转移能力的实验中,我们发现挽救组的肺转移灶数目恢复到与对照组相当的水平,显著高于KLF9过表达组。以上结果提示,过表达MMP28能够有效地挽救由过表达KLF9导致的胃癌细胞转移能力降低的表型。综上所述,本研究通过生物信息学分析、细胞生物学验证以及动物模型体内验证等多种实验手段,发现了一个全新的抑制胃癌转移的转录因子——KLF9。通过进一步的分析和验证,我们证实了 KLF9通过介导MMP28的转录沉默来抑制胃癌转移的分子机制。本研究对于阐明胃癌转移过程的分子机制有一定意义,并为治疗胃癌转移提供了新的思路和药物靶点。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

流程图,胃癌组织,转录因子,胃癌

逦实验结果逡逑图３．１．２筛选与胃癌转移相关的转录因子。（Ａ）筛选流程图。首先通过比较Ｃ１和Ｃ２两逡逑组胃癌病人的差异表达基因分析，得到１７７０个差异基因，筛选标准为ｌｏｇ２（Ｃｌ／Ｃ２）＞ｌ或＜－１，逡逑Ｐ＜０．０５。（Ｂ）韦恩图显示，Ｃ１与Ｃ２组比较后得出下调的１４０８差异基因与ＦＡＮＴＯＭ５转录逡逑因子数据库取共同基因，再与ＴＣＧＡ胃癌样本中癌组织与癌旁组织的差异基因取交集，进一逡逑步通过与ＧＳＥ１９８２６，邋ＧＳＥ２９２７２，邋ＧＳＥ１３９丨１，ＧＳＥ１３８６１这四个胃癌芯片中的差异表达基因逡逑取交集，最终筛选出与胃癌转移相关的５个转录因子。值得注意的是，３６２个ＣＩ相对于Ｃ２逡逑上调的基因中并未筛选出有代表性的胃癌转移相关转录因子。筛选差异基因的标准为逡逑ｌｏｇ２（Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｒｍａｌ）＞ｌ或＜－１，尸＜０．０５。（Ｃ）列表所示为５个胃癌相关转录因子，包含其基逡逑因名、全称、在ＴＣＧＡ数据库中的癌组织比癌旁组织差异变化倍数和直等信息。逡逑３．２邋ＫＬＦ９在发生远端转移胃癌病人中表达量下降逡逑３．２．１邋ＫＬＦ９在胃癌组织中的表达董相较于癌旁组织显著下降逡逑为了确定ＫＬＦ９在胃癌发生发展过程中的表达情况，我们分析了邋ＴＣＧＡ中胃逡逑癌测序数据和ＧＳＥ１９８２６、ＧＳＥ２９２７２、ＧＳＥ１３９１１、ＧＳＥ１３８６１这４个胃癌芯片数逡逑据中ＫＬＦ９基因的表徸情况。结果显示

流程图,表达水平,转录因子,胃癌

分析显示,癌症

浙江大学博士学位论文逦逦逦实验结果逡逑３．２．３逦ＧＳＥＡ分析显示ＫＬＦ９表达量与癌症转移显著负相关逡逑为了探究ＫＬＦ９的表达情况与癌症转移的相关性，我们针对ＴＣＧＡ数据库中逡逑３８８例胃癌样本进行了基因集富集分析（Ｇｅｎｅｓｅｔｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，邋ＧＳＥＡ）。首逡逑先，我们将３８８例胃癌样本按照ＫＬＦ９表达模式分为ＫＬＦ９高表达和ＫＬＦ９低表达逡逑两组，每组各１９４例。经过基因集富集分析，结果显示ＫＬＦ９的表达量与多个癌症逡逑转移相关的基因集和肿瘤侵袭能力相关基因集呈现明显负相关，即ＫＬＦ９的低表达逡逑某种程度上提示肿瘤更倾向于发生转移（图３．２．３）。此外，ＫＬＦ９还与胃癌早期发逡逑生的基因集呈现显著负相关，这也印证了邋ＫＬＦ９在胃癌发生发展中起着抑制作用。逡逑以上结果进一步提示我们ＫＬＦ９可能扮演着癌症转移抑制因子的角色。逡逑ＰＲＯＶＥＮＺＡＮＩ＿ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ＿ＵＰＡ

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