miRNA-181b参与TGF-β诱导胃癌细胞上皮间质转化的机制研究

发布时间：2020-08-03 07:08

【摘要】：目的:胃癌(Gastric Cancer,GC)作为一种恶性消化道肿瘤,严重危害人类生命健康,加强对胃癌病因学及发病机制的研究,对胃癌的预防和早期诊治具有重要的意义。上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在胃癌的发生和进展中起着举足轻重的作用,EMT可使胃癌细胞间的黏附能力减弱,促进胃癌细胞脱落、并赋予其迁移能力,从而使胃癌细胞产生远处转移。转化生长因子β(TGF-β)在肿瘤生长中扮演重要角色,在早期肿瘤中限制上皮细胞和肿瘤细胞的繁殖,但在晚期肿瘤中激活EMT,加速肿瘤的进展和转移。miRNA-181家族在多种恶性肿瘤(乳腺癌、肺癌、肝癌、血液病、胰腺癌、胃癌及胶质瘤等)的增殖、分化、凋亡、侵袭、转移及化疗耐药中扮演重要角色。其中miRNA-181b在胃癌中过表达,miRNA-181b也与以BCL2为靶点的多重耐药相关。但是,TGF-β诱导的miRNA-181b在胃癌发生与转移过程中扮演角色的潜在机制尚未被彻底阐明。并且在TGF-β诱导的EMT过程中,miRNA-181b的直接靶基因仍尚未被识别。因此,本研究旨在明确miRNA-181b及其直接作用靶点和TGF-β-Smad2/3/4通路与胃癌EMT表型之间的关系。方法:本研究选用人胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、HGC-27和AGS),通过划痕实验、细胞侵袭等实验,探究TGF-β调节细胞生物学行为的能力。通过转染使用miRNA-181b类似物和抑制剂来调控miRNA的表达及对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过免疫荧光及激光共聚焦检测胃癌细胞骨架蛋白F-actin评估胃癌细胞形态变化。miRNA-181b,EMT标记基因及miRNA-181b潜在靶基因等的表达由实时荧光定量PCR检测分析。利用免疫印迹法(Western Blot)分析磷酸化Smad2和Smad4水平。构建含Smad4特异性siRNA序列的慢病毒载体,并筛选获得Smad4稳定敲减的胃癌细胞株。利用双荧光素酶报告实验验证miRNA-18lb与Timp3的直接结合。构建Timp3过表达稳定表达胃癌细胞株进行回复实验。最后通过Balb/cNOD荷瘤小鼠体内实验验证miRNA-181b-Timp3通路对胃癌细胞增殖和迁移的作用。结果:TGF-β刺激能显著促进胃癌细胞的迁移(HGC-27:P=0.014;AGS:P=0.021),侵袭能力(HGC-27:P=0.002;AGS:P=0.011)以及EMT的发生,并且显著上调miRNA-181b 前体(MKN-28:P=0.033;SGC-7901:P=0.008;HGC-27:P=0.004;AGS:P=0.003)及成熟体(MKN-28:P=0.041;SGC-7901:P=0.003;HGC-27:P=0.009;AGS:P=0.005)在胃癌细胞株中的表达。miRNA-181b类似物的过表达在体外诱导了胃癌细胞的EMT样改变,其表型与单用TGF-β诱导的EMT效应类似,且可被miRNA-181b抑制剂逆转(HGC-27:P=0.036;AGS:P=0.024)。使用 TGF-β RⅠ/Ⅱ 特异性抑制剂 SD-208阻滞TGF-β-Smad2/3信号通路,可显著抑制TGF-β诱导的miRNA-181b前体(HGC-27:P=0.037;AGS:P=0.006)和成熟体(HGC-27:P=0.017;AGS:P=0.012)的上调。抑制Smad4基因同样可显著抑制胃癌细胞株中TGF-β诱导的miRNA-181b前体(HGC-27:P=0.042;AGS:P=0.036)和成熟体(HGC-27:P=0.039;AGS:P=0.021)的上调。miRNA-181b直接靶向作用于Timp3 mRNA的3'-非翻译区(3'UTR),抑制Timp3的表达,影响TGF-β诱导胃癌细胞的EMT过程。体内实验发现,miRNA-181b-Timp3通路对于胃癌细胞的增殖无显著作用,但是显著促进胃癌细胞的迁移能力(P=0.021)。结论:上述结果揭示了 TGF-β通路调控胃癌细胞EMT发生的新机制,即TGF-β经由依赖Smad2/3/4的通路,转录激活miRNA-181b水平,miRNA-181b靶向抑制Timp3的表达,诱导EMT发生。该发现揭示了肿瘤细胞微环境调控EMT的新机制,有望指导将来针对此类机制的靶向治疗研究。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

人胃癌细胞,细胞株,机制研究,胃癌细胞

逦ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ参与ＴＧＦ－（３诱导胃癌细胞上皮间质转化的机制研究逡逑侵袭能力的变化，结果发现ＴＧＦ－Ｐ刺激显著增强肿瘤细胞的侵袭能力，见图１－１。逡逑Ｂｌａｎｋ逦ＴＧＦ－ｐ逦Ｂｌａｎｋ逡逑k酬逡逑图１－１．邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测ＴＧＦ－ｐ刺激（５邋ｎｇ／ｍｌ，邋２４小时）前后人胃癌细胞ＨＧＣ－２７，邋ＡＧＳ细胞株逡逑的侵袭能力差异。＊户＜0．0５，＊＊Ｐ＜０．０１比对照组。逡逑２．

实验检测,人胃癌细胞,表达差异,细胞株

为了探索ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ与ＴＧＦ－ｐ刺激的关系，我们利用ＴＧＦ－Ｐ邋（５邋ｎｇ／ｍｌ）时间梯度逡逑（０、１２、２４、４８小时）刺激人胃癌细胞株ＭＫＮ－２８，ＳＧＣ－７９０１，ＨＧＣ－２７和ＡＧＳ细胞逡逑株，通过实时荧光定量ＰＣＲ实验检测ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前体及成熟体的表达量，如图１－４逡逑所示，结果发现ＴＧＦ－ｐ刺激１２小时后，仅有ＳＧＣ－７９０１细胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ成熟体升逡逑高具有统计学差异，其余三株无显著改变；ＴＧＦ－卩刺激２４小时后，ＳＧＣ－７９０１，ＡＧＳ逡逑和ＨＧＣ－２７三株细胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前体和成熟体的表达量均显著升高；ＴＧＦ－ｐ刺激逡逑４８小时后，四株胃癌细胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前体和成熟体的表达量均显著升高。结果提逡逑示，ＴＧＦ－ｐ刺激可以显著激活ｍｉＲＮＡ－１８ｌｂ的转录水平，但是目前关于ＴＧＦ－ｐ激活逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的转录水平尚未在胃癌中发现，并且ＴＧＦ－Ｐ通过何种机制调控逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的转录激活，目前尚不清楚，为了阐明此问题，我们将后续进一步进行逡逑探索。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑Ｃ逡逑0逡逑．１逦Ｓ逡逑巴邋６逦口邋０邋ｈｏｕｒ邋ｇ－邋６逦ｒ邋？？邋，逦□邋０邋ｈｏｕｒ逡逑＾逦１邋□邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋ｎ逦N逦ｉ—＾邋0邋１２邋ｈｏｕｒｓ逡逑５邋§邋４－逦＾邋０邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋ｊ邋§邋４．逦２４邋ｈｏｕｒｓ逡逑Ｊ邋ｗ逦■邋Ｉ邋Ａ邋■邋４８邋ｈｏｕｒｓ邋ｚ邋＾逦

人胃癌细胞,实验检测,实时荧光定量PCR

图１－３．实时荧光定量ＰＣＲ实验检测ＴＧＦ－ｐ刺激（５邋ｎｇ／ｍｌ，２４小时）前后人胃癌细胞ＨＧＣ－２７逡逑（Ａ），ＡＧＳ邋＜Ｂ）细胞株中邋ＥＭＴ邋指标（Ｅ－ｃａｄｔ＇ｈｅｒｉｎ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ，邋Ｚｅｂｌ邋和邋Ｓｎａｉｌｌ）的表达差异。＊／＞＜０．０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０丨比对照组。逡逑为了探索ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ与ＴＧＦ－ｐ刺激的关系，我们利用ＴＧＦ－Ｐ邋（５邋ｎｇ／ｍｌ）时间梯度逡逑（０、１２、２４、４８小时）刺激人胃癌细胞株ＭＫＮ－２８，ＳＧＣ－７９０１，ＨＧＣ－２７和ＡＧＳ细胞逡逑株，通过实时荧光定量ＰＣＲ实验检测ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前体及成熟体的表达量，如图１－４逡逑所示，结果发现ＴＧＦ－ｐ刺激１２小时后，仅有ＳＧＣ－７９０１细胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ成熟体升逡逑高具有统计学差异，其余三株无显著改变；ＴＧＦ－卩刺激２４小时后，ＳＧＣ－７９０１，ＡＧＳ逡逑和ＨＧＣ－２７三株细胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前体和成熟体的表达量均显著升高；ＴＧＦ－ｐ刺激逡逑４８小时后，四株胃癌细胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前体和成熟体的表达量均显著升高。结果提逡逑示，ＴＧＦ－ｐ刺激可以显著激活ｍｉＲＮＡ－１８ｌｂ的转录水平，但是目前关于ＴＧＦ－ｐ激活逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的转录水平尚未在胃癌中发现，并且ＴＧＦ－Ｐ通过何种机制调控逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的转录激活，目前尚不清楚，为了阐明此问题，我们将后续进一步进行逡逑探索。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑Ｃ逡逑

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