成纤维细胞CD147分子重编程肿瘤微环境调节乳腺癌进展的功能研究

发布时间：2020-08-04 19:31

【摘要】：癌症是威胁人类生命健康的重大疾病。依据2015年的统计结果,全球每年癌症新发病例已经接近1500万。其中,不论是在发展中国家或是在发达国家,乳腺癌都高居女性新发癌症类型的榜首。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)在乳腺癌发生发展中的作用不容忽视。癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAFs)作为构成乳腺肿瘤微环境的主要及重要基质细胞,可以通过分泌细胞因子和各种生长因子等方式改变肿瘤微环境,参与乳腺癌发生发展的多个环节,包括促进肿瘤新生血管生成、促进癌细胞增殖、侵袭、转移等。通过靶向基质CAFs来抑制肿瘤也已成为抗癌治疗发展的新型策略。但是,参与CAFs形成并介导其促癌进展功能的关键分子仍未完全阐明,目前能够作为靶向基质的细胞膜表面药靶分子也仍缺乏。因此,本研究以乳腺癌为研究对象,采用原代细胞培养、质谱分析等方法,在患者样本、条件性基因敲除小鼠、NOG小鼠、及原代培养细胞等体内外模型中,鉴定参与CAFs形成并介导其促癌进展功能的关键表型分子,并探索该分子在调节肿瘤微环境及乳腺癌进展中的功能作用。预期为阐明CAFs促进肿瘤进展的分子机制提供实验证据,也为开发靶向肿瘤微环境的治疗策略提供新的靶点。研究分为以下三个部分:第一部分:癌相关成纤维细胞表型分子CD147的发现与鉴定。已有研究发现,原代培养的CAFs仍可保持其在体内的主要表型特点,因此,我们首先建立了从乳腺癌组织中原代分离培养CAFs的方法,并成功分离获得同一浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)患者组织中的CAFs、癌旁成纤维细胞、正常乳腺成纤维细胞及皮肤成纤维细胞,并对4种细胞分别提取总蛋白,进行质谱分析。结果发现,I型跨膜蛋白CD147分子(基因名Basigin,简称Bsg)仅在CAFs中能够检出,而在其它3种成纤维细胞中未能检出。对4种细胞蛋白进行免疫蛋白印记检测发现,CAFs中CD147分子表达明显高于癌旁及正常成纤维细胞,且其表达水平与CAFs的标志物αSMA存在正相关趋势。流式细胞检测也显示CAFs细胞表面CD147分子表达明显高于正常成纤维细胞。随后,我们在正常乳腺、乳腺纤维腺瘤、和不同WHO组织分级的乳腺癌组织样本中,对CD147和αSMA进行免疫荧光双染色,发现在正常乳腺和乳腺良性疾病组织的间质中,未检测到CD147和αSMA的表达和共定位,而在乳腺癌组织的间质中,两者存在明确的共定位。进一步对具有不同组织分级的IDC患者样本进行两者荧光双标记检测,结果显示,在肿瘤间质中,CAFs标志物αSMA与CD147存在共定位,且CD147的表达随组织分级的增高存在增强的趋势。因此,我们采用乳腺癌组织芯片对127例254点IDC样本进行免疫荧光双标记检测,结果发现,肿瘤间质中,CD147和αSMA共定位,CD147分子的表达强度与肿瘤组织分级呈显著正相关,乳腺癌恶性程度越高,间质中CD147分子的表达越强。以上结果提示,CD147可能是CAFs的新型表型分子,间质CAFs中CD147分子的表达与IDC的恶性程度显著相关,可能在乳腺癌的恶性进展中发挥重要功能。第二部分:成纤维细胞CD147影响乳腺癌进展的功能研究。为在体内条件下探究成纤维细胞CD147对乳腺癌恶性进展的影响。我们对科室自行构建的C57129sv混合背景的条件打靶小鼠Bsg~(fl/fl)进行了向Balb/c背景的6代背景纯化,再与源自Jackson Lab的S100A4-Cre转基因小鼠进行交配,获得了成纤维细胞特异性敲除CD147基因小鼠,并对该小鼠进行了表型鉴定。采用PCR对富含成纤维细胞的乳腺、肺、肠、皮肤等组织基因组DNA进行检测,结果显示,成纤维细胞特异性敲除CD147基因小鼠中能够检测到明显的敲除条带。在原代分离的小鼠乳腺成纤维细胞中,除PCR检测到明确的敲除条带外,免疫蛋白印记和流式细胞染色结果均显示,在敲除小鼠中,CD147分子在蛋白质水平和细胞水平均被成功敲除。对成纤维细胞特异性敲除CD147基因小鼠进行表型鉴定,结果显示,敲除小鼠与同窝对照小鼠相比,无明显生理活动改变,各主要脏器大体结构和显微结构正常,小鼠繁殖能力正常,可用于后续实验研究。对成纤维细胞特异性敲除CD147基因小鼠原位接种小鼠乳腺癌细胞系4T1,结果显示,敲除小鼠较同窝对照小鼠肿瘤形成时间显著延迟,肿瘤体积减小、瘤重减轻、肺内转移灶减少、且小鼠生存期延长,提示,敲除成纤维细胞中的CD147分子能够显著抑制乳腺癌的恶性进展。随后,在原代分离培养敲除小鼠及对照小鼠的乳腺成纤维细胞中,我们发现,在体外培养条件下,CD147基因的敲除,显著抑制了小鼠乳腺成纤维细胞的活化程度。此外,通过Ki67染色、TUNEL检测以及CD31染色,我们检测了成纤维细胞特异性敲除CD147基因小鼠肿瘤组织中癌细胞的增殖、凋亡及肿瘤新生血管情况。结果显示,与对照小鼠相比,敲除小鼠肿瘤组织中癌细胞的增殖显著减弱,细胞凋亡显著增强,且肿瘤新生血管显著减少。以上结果提示,成纤维细胞敲除CD147基因可能抑制成纤维细胞活化,并通过抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤新生血管生成,并促进细胞凋亡,进而抑制乳腺癌的恶性进展,延长小鼠生存期。成纤维细胞CD147分子可能在CAFs活化形成及促癌功能中发挥重要作用。第三部分:干预癌相关成纤维细胞CD147抑制乳腺癌进展的功能与机制研究。为探究已处于活化状态的CAFs中高表达的CD147分子在乳腺癌进展中的功能和作用机制,我们采用携带CD147-shRNA(或无关shRNA)的慢病毒感染原代分离培养的CAFs,沉默CAFs中CD147表达后,与人乳腺癌细胞MBA-MD-231等量混合,接种于三联免疫缺陷的NOG小鼠乳腺脂肪垫中。结果显示,沉默CAFs中CD147分子的表达显著抑制了肿瘤的成瘤时间和生长,沉默组小鼠的肿瘤体积和瘤重均显著小于无关干涉的对照组。随后,通过Ki67染色、TUNEL检测以及CD31染色,我们检测了NOG小鼠肿瘤组织中癌细胞增殖、凋亡及肿瘤新生血管生成的情况。结果显示,与对照小鼠相比,沉默CAFs中CD147分子组小鼠肿瘤组织中癌细胞增殖和肿瘤新生血管生成显著受到抑制,而细胞凋亡比例显著增强。提示沉默CAFs中CD147分子能够通过影响肿瘤细胞的多种恶性行为,包括细胞增殖、细胞凋亡、新生血管生成等,显著抑制乳腺癌的恶性进展。为进一步探究CAFs中CD147分子影响乳腺癌进展的分子机制,我们对沉默组和对照组小鼠瘤块总蛋白进行了iTRAQ质谱分析。结果显示,质谱中共检测肽段42134种,检测蛋白6150种,其中差异表达蛋白352种。KEGG数据库分析结果显示,检测出的蛋白在癌症信号通路、内吞作用以及PI3K-Akt信号通路中分布的蛋白数量较多。在PI3K-Akt信号通路中分布蛋白数量达到102个。应用Western Blot阵列技术,我们通过条件培养基刺激的方式在体外对质谱结果进行了验证。结果显示,干涉癌相关成纤维细胞CD147后,磷酸化Akt及磷酸化SAPK/JNK下调。使用干涉CD147后癌相关成纤维细胞培养上清刺激MBA-MD-231细胞后,MBA-MD-231细胞磷酸化Akt及下游磷酸化mTOR水平下调。提示干预癌相关成纤维细胞CD147分子对乳腺癌的抑制作用可能是通过抑制癌相关成纤维细胞及肿瘤细胞中的Akt通路发挥作用的。综上所述,本研究发现CD147可能是癌相关成纤维细胞的新型表型分子,该分子在癌相关成纤维细胞中的表达与乳腺癌恶性程度显著相关。在成纤维细胞特异性敲除CD147基因小鼠模型中,CD147的缺失会抑制成纤维细胞活化。进而通过影响乳腺癌细胞的增殖、凋亡和血管生成来抑制乳腺癌恶性进展。对于已活化的癌相关成纤维细胞,干涉CD147能够逆转其促癌作用,通过影响乳腺癌细胞的增殖、凋亡和血管生成来抑制乳腺癌进展。这一现象,可能与PI3K/Akt等通路相关。上述研究确定了癌相关成纤维细胞的全新表型分子CD147,同时确定了该表型分子在乳腺癌恶性进展中的作用,并为靶向肿瘤微环境的药物治疗发展提供了新靶点和理论依据。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

乳腺癌,亚型

图 1 乳腺癌分子分型中各个亚型的定义[8]1.1.4 组织病理学分类临床中，除了上述三种分类方法，乳腺癌也能通过其组织学外观进行分类。依据乳腺癌来源的不同可以将乳腺癌分为导管癌或小叶癌。再依据乳腺癌的浸润情况，可以将其分为原位癌和浸润癌。其中，原位癌是指癌灶局限于特定的组织隔室中而不入侵隔室外的组织。相反，浸润癌指不局限于最初组织隔室的乳腺癌。其中浸润性导管癌（IDC）是最常见的乳腺癌类型[9]。1.2 乳腺癌与肿瘤基质相比于其他类型的癌症，诸多研究表明，乳腺癌的发生发展中存在明显的癌-基质交互作用。由于乳腺癌中腺体较多，脂肪组织较多等客观因素的存在，乳腺癌中含有更多的肿瘤间质。多个研究证实，正常乳腺间质以及乳腺癌间质之间存在多种差异。这些差异体现在基因表达，细胞因子分泌等诸多方面。因此，针对乳腺癌肿瘤微环境的研究具有重要意义[10]。

浸润性导管癌,免疫荧光染色,组织切片,患者

图 1-1 5 例浸润性导管癌（IDC）患者组织切片免疫荧光染色5 例浸润性导管癌（IDC）患者组织切片 αSMA 免疫荧光染色结果显示，在浸润性导管癌的肿瘤间质中，CAFs 大量分布。主要位于肿瘤间质中，包绕在癌巢周围或与癌细胞间杂分布，提示 CAFs 与癌细胞间存在密切的相互作用。3.2 人原代成纤维细胞的分离培养与纯度鉴定为建立可靠且重复性高的原代成纤维细胞分离培养方法，我们首先从 3 例患者的乳腺癌组织及正常乳腺中分别原代分离了 CAFs 和正常成纤维细胞（FB），并对成纤维细胞标志物 vimentin 及 CAF 标志物 αSMA 进行了免疫荧光双标染色（图 1-2）。

浸润性导管癌,免疫荧光染色,标志物,组织切片

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