GPX8在非小细胞肺癌中的表达及其功能研究

发布时间：2020-08-06 22:07

【摘要】：研究背景和目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%以上,是导致癌症死亡的常见原因。NSCLC的形成是一个复杂及多步骤的发展过程,它的异质性高、生物学特性复杂,这就意味着发展适合于每种类型NSCLC特定治疗方式的必然性。在NSCLC起始阶段和肿瘤进展中发现更多的发挥关键作用的肿瘤分子机制,以及寻找更多灵敏度高和特异性强的肿瘤标志物,对于NSCLC的诊疗显得尤为重要。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)不仅在抗氧化反应中具有关键作用,而且在物质代谢及信号转导中发挥着重要的作用。研究发现GPX基因家族在人类的多种肿瘤中异常表达。GPX8是家族中被最后确认的成员,目前对于它的认识还知之甚少,尤其在肿瘤中的研究更是鲜为人知。基于GPX家族在肺癌中的研究现状,本课题拟从以下方面探索GPX8在NSCLC中发挥的主要作用。首先是应用生物信息数据及收集的NSCLC患者的组织样本和临床资料分析GPX8在NSCLC中的表达情况以及与患者预后的相关性。其次在体外水平研究干扰GPX8表达后,对NSCLC生长及迁移侵袭等生物学功能的影响。经高通量转录组测序技术探索GPX8在NSCLC中发挥的可能作用机制及分子调控网络。研究方法1.收集具有完整临床资料的NSCLC患者的新鲜组织,以及蜡块组织并制作组织芯片。采用Westernblot、RT-qPCR、IHC技术检测GPX8在NSCLC患者中表达情况及与临床病理参数间的关系。应用TCGA数据库及IHC染色结果分析GPX8在NSCLC中的表达情况与患者预后的相关性。2.以NSCLC细胞系A549细胞和H520细胞为主要研究对象,进一步探讨GPX8对NSCLC细胞生物学行为的影响。运用平板克隆形成实验、CCK-8、细胞划痕、等实验,综合分析GPX8在干扰前后对NSCLC细胞的细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、以及对其迁移与侵袭能力的影响。3.采用转录组测序技术分析GPX8干扰前后,差异表达基因的变化情况及其主要富集的信号通路。结果1.本课题组制作了六个包含282例NSCLC患者的的组织芯片。经过IHC染色后,相应的组织芯片有效利用率为88.3%。组织芯片制作结果较为理想。2.肿瘤组织中GPX8的阳性率远高于正常肺组织,分别为66.7%及26.7%,具有显著的统计学差异(X2 = 9.643,P0.01)。GPX8的高度表达往往发生在肿瘤直径较大、病理分化程度较低、TNM分期较晚及出现肿瘤复发的NSCLC患者中。并且GPX8在肺腺癌中的表达高于其他NSCLC的病理类型。经统计学分析发现GPX8阳性者的五年生存率较阴性患者要低(P=0.001),与TCGA生物信息学分析的结果一致。3.应用平板克隆形成实验和CCK-8实验发现,GPX8降表达后,贴壁的A549细胞和H520细胞的增殖能力下降,形成的克隆数明显减少(P0.001)。进一步采用流式细胞术检测GPX8对它们细胞周期及细胞凋亡的影响,发现干扰GPX8表达后,并未对A549和H520的细胞周期造成明显的影响。但GPX8降表达后,A549和H520细胞的早期凋亡比例明显升高,依次为:16.25±1.06,9.45±1.06;高于对照组 2.85±0.92,3.85±1.06。4.在细胞划痕实验及Transwell实验中,我们发现干扰GPX8表达后,A549细胞和H520细胞的定向迁移能力明显减弱,A549-shGPX8和H520-shGPX8穿过Matrigel胶小室的细胞数量较对照组明显减少,迁移侵袭能力随之下降。5.在A549细胞内干扰GPX8表达后,显著性差异表达的基因共计413个。经过KEGG富集分析发现这些差异表达的基因主要富集在癌症通路及PI3K-Akt信号通路中。结论1.在NSCLC中,GPX8的表达水平呈现上调趋势,与多项不良的临床病理参数成正相关。2.GPX8是造成NSCLC患者预后不良的因素之一,可作为评判NSCLC患者预后的肿瘤分子标记物。3.在肺腺癌中,GPX8的表达远高于其他病理类型,可作为鉴别NSCLC病理分型的重要依据。4.在NSCLC中,GPX8促进肿瘤细胞的增殖与侵袭,并抑制其凋亡。5.干扰GPX8的表达后,利用高通量的测序技术发现了 A549细胞内的显著差异性表达基因及其所富集的主要信号通路。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

苏木素,伊红,操作流程,示意图

图１．１制作ＴＭＡ的简易操作流程示意图逡逑１．１．３．２苏木素－伊红染色逡逑

蜡块,非小细胞肺癌

我们制作了六个包含２８２例ＮＳＣＬＣ患者的ＴＭＡ蜡块，其中包括３０例肺癌逡逑患者相对应的正常肺组织；ＴＭＡ蜡块依次编号为Ｌｕｎｇ①至Ｌｕｎｇ⑥，除Ｌｕｎｇ⑥逡逑ＴＭＡ蜡块上为４２个芯片点外，其余皆为４８个芯片点。如图１．２所示，所有ＴＭＡ逡逑蜡块及切片上的芯片点排列整齐，在每张ＴＭＡ切片上未出现皱褶现象，个别芯逡逑片点出现移位，多发生在起始端。ＴＭＡ切片上位于上端独立成列的点为识别点。逡逑随机选取每个编号的ＴＭＡ切片各十张，在这些ＴＭＡ切片上观察到平均共有９逡逑个芯片点发生完全脱落，组织芯片利用率为９６．８％，ＴＭＡ切片制作效果优良，逡逑可用于后续的实验。逡逑—逦逦１．逦逦Ｉ逡逑图１．２非小细胞肺癌ＴＭＡ蜡块及切片逡逑１．２．邋２非小细胞肺癌组织芯片的ＨＥ染色逡逑将六张ＴＭＡ切片全部进行ＨＥ染色（图１．３），发现有１５个芯片点发生脱逡逑落，ＴＭＡ的ＨＥ切片利用率为９４．６％。在显微镜下观察每个芯片点的染色情况逡逑及形态学结构，评判所有供体蜡块组织芯植入ＴＭＡ蜡块后是否存在富含肿瘤细逡逑胞目的靶点的偏移甚至发生脱靶现象（图１．４）。每个芯片点的组织内除了肿瘤逡逑成分

非小细胞肺癌,肿瘤细胞

图１．３非小细胞肺癌ＴＭＡ切片ＨＥ染色结果逡逑ｍｍ逡逑ＨＥ染色，５Ｘ逡逑图１．４非小细胞肺癌ＴＭＡ切片ＨＥ染色，图Ａ黑色箭头指向的区域为肿瘤细胞逡逑成分，可以看到肿瘤组织明显出现偏移，并且肿瘤细胞含量不足２５％，造成此逡逑靶点偏移的主要原因就是供体蜡块的定位出现问题；图Ｂ所有黑色箭头指向的逡逑粉染区域皆是肿瘤坏死区，在肺的鳞状细胞癌中常常伴有肿瘤细胞的坏死。逡逑１１逡逑

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