CBX8在肿瘤转移中的功能及机制研究

发布时间：2020-08-06 23:09

【摘要】：研究背景:转移是影响肿瘤预后的重要生物学行为,其过程由肿瘤细胞迁移、侵袭等多个步骤组成。迁移主要是指肿瘤细胞内细胞骨架变化引起的细胞变形以及肿瘤细胞所处位置的变化。RAC1是影响肿瘤细胞迁移的重要分子,它可通过影响细胞骨架重要组成成分β-acting进而影响细胞的迁移能力。侵袭主要是指肿瘤细胞分泌相关成分,降解基底膜或细胞周围结缔组织成分,为肿瘤细胞的生长提供空间。MMP2可降解基底膜或细胞周围成分,是决定肿瘤细胞侵袭能力的重要分子之一。肿瘤细胞通过迁移、侵袭等多个步骤完成转移。研究发现,WNK2对RAC1和MMP2均具有负相调节作用,进而影响肿瘤的迁移和侵袭能力。CBX8隶属于CBX蛋白家族,可与RING1a/b、BMI1等蛋白分子组成多梳蛋白抑制复合体1(polycomb repressive complex 1,PRC1),与PRC2共同诱导并维持基因的抑制状态。CBX8在脑胶质瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤组织中表达升高,促进肿瘤的发生、发展,如诱导白血病的发生、促使肿瘤细胞去分化、延缓肿瘤细胞衰老等。目前,多数研究认为CBX8属于癌基因,但结论并不确切。因此,通过研究不同肿瘤类型中CBX8的作用,可以更为确切的了解CBX8在肿瘤发生发展中的作用及机制。研究方法:1.CBX8在肿瘤组织中的表达情况:通过c Bio Portal for Cancer Genomics检测CBX8在脑胶质瘤、乳腺癌和肺癌中的表达情况及对预后的影响。2.构建CBX8过表达及低表达细胞系:选取脑胶质瘤(U251MG,T98G)、乳腺癌(MCF7,MDA-MB-231)和肺癌(A549)为研究对象。构建反转录病毒载体的CBX8过表达及低表达质粒,Lipofectamine 2000诱导转染上述细胞系,G418筛选CBX8过表达细胞系,Puromycin筛选CBX8低表达细胞系,建立稳转细胞系。q RT-PCR及western blot验证CBX8表达情况。3.检测不同CBX8表达情况下细胞迁移能力变化:以CBX8不同表达情况的U251MG、MCF7和A549为研究对象,进行划痕实验,通过比较无细胞覆盖区域面积评估细胞迁移能力。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,进行Transwell迁移能力检测实验,通过计数相同时间内穿过小室的细胞数量评估细胞的迁移能力。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,培养相同时间后,经三步染色法染色,观察细胞形态变化,初步评估细胞骨架的变化情况。使用Alexa FluorTM 568 phalloidin对上述细胞的细胞骨架进行染色,共聚焦显微镜观察细胞β-acting含量及分布变化,以及细胞形态变化。4.检测不同CBX8表达情况下细胞侵袭、转移能力变化:以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,进行Transwell侵袭实验,通过计数相同时间内穿过小室的细胞数量评估细胞的侵袭能力。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,转染Luciferase基因,构建稳转细胞系。以免疫缺陷的NSG小鼠为研究对象,经尾静脉注射建立肺转移动物模型。饲养4-6周后,通过小动物活体成像技术评估肺转移情况。记录小鼠体重及肺组织重量,间接评估肺转移情况。通过HE染色观察发生转移的肺组织变化情况。5.CBX8不同表达情况对WNK2、RAC1和MMP2的影响:以CBX8不同表达情况的U251MG、T98G、MCF7、MDA-MB-231和A549为研究对象,q RT-PCR检测WNK2、RAC1和MMP2含量变化。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,使用RAC1、MMP2活性检测试剂盒检测细胞系中RAC1和MMP2活性。NSG小鼠建立动物模型后4-6周,取外周血,使用MMP2活性检测试剂盒检测血清中RAC1和MMP2活性。以CBX8过表达的MDA-MB-231为研究对象,染色质免疫共沉淀技术验证CBX8是否与WNK2启动子区域结合。6.WNK2对RAC1和MMP2调节作用的验证:以U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,使用si RNA转染上述细胞,q RT-PCR检测WNK2表达情况后,选择WNK2明显降低细胞系为研究对象,q RT-PCR检测RAC1和MMP2表达含量的变化,并与CBX8差异性表达细胞系中表达含量变化进行比较。结果:1.通过c Bio Portal for Cancer Genomics检索发现,CBX8在不同肿瘤组织中均有不同程度的升高,特别是在脑胶质瘤、乳腺癌和肺癌中升高明显。通过c Bio Portal for Cancer Genomics分析脑部肿瘤、乳腺癌和肺癌的总体生存率发现,CBX8高表达可明显降低脑胶质瘤患者总体生存率(P=9.13e-05),而乳腺癌及肺癌中的结果无统计学差异。2.成功建立U251MG、T98G、MCF7、MDA-MB-231和A549的CBX8过表达和低表达稳转细胞系,并通过q RT-PCR和western blot进行验证。3.以CBX8不同表达情况的U251MG、MCF7和A549为研究对象,进行划痕实验,比较72小时后空白区域面积发现,随着CBX8表达含量的升高,空白区域均有不同程度的缩小,提示CBX8表达含量的升高可以促进肿瘤细胞迁移能力的升高。其中U251MG和MCF7细胞系中,CBX8对照组和低表达组与CBX8过表达组之间的差异具有统计学意义。A549细胞系中,仅CBX8过表达组与低表达组之间具有统计学意义,对照组与过表达组之间无统计学意义。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,进行Transwell细胞迁移实验。处理8小时后,三步染色法染色细胞,比较穿过小室细胞数量的变化。结果提示,随着CBX8表达含量的升高,穿过小室的数量逐渐增多,再次提示CBX8表达含量的升高可以促进肿瘤细胞迁移能力的升高。U251MG、MDA-MB-231和A549细胞系中,CBX8对照组和低表达组与CBX8过表达组之间的差异均具有统计学意义。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,常规培养24小时后,经三步染色法染色,发现细胞形态存在差异。随着CBX8含量的升高,细胞由圆形向梭形逐渐转变。对上述细胞进行Alexa FluorTM 568 phalloidin染色发现,随着CBX8含量的升高,各组细胞中β-acting表达含量明显增多且向细胞膜方向分布,提示细胞骨架结构活动增强。4.以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,进行Transwell侵袭能力检测实验,处理24小时后,三步染色法染色细胞,比较穿过小室细胞数量的变化。结果显示,随着CBX8表达含量的升高,穿过小室的细胞数量逐渐增多,提示CBX8表达含量的升高可以促进肿瘤细胞侵袭能力的升高。U251MG和MDA-MB-231细胞系中,CBX8对照组和低表达组与CBX8过表达组之间的差异具有统计学意义。A549各组之间差异仅有趋势变化,无统计学意义。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,成功建立Luciferase基因稳转细胞系。以NSG小鼠为研究对象,成功建立尾静脉注射的肺转移动物模型。饲养4-6周后行小动物活体成像发现,随着CBX8表达含量的升高,肺部转移的发生率明显升高,且肺部荧光明显增强,提示肺部转移情况更为严重。比较CBX8对照组、低表达组和过表达组小鼠体重及肺组织重量发现,随着CBX8的升高,小鼠体重逐渐降低,肺组织重量逐渐升高,间接提示肺转移情况逐渐加重。HE染色发现,随着CBX8表达含量的升高,小鼠肺组织中的转移灶数量逐渐增多,且转移灶面积逐渐增大,直接提示肺部转移情况的加重。5.以CBX8不同表达情况的U251MG、T98G、MCF7、MDA-MB-231和A549为研究对象,q RT-PCR检测WNK2、RAC1和MMP2含量变化。结果显示:随着CBX8表达含量的逐渐升高,WNK2表达含量逐渐降低,RAC1和MMP2表达含量逐渐升高,提示CBX8与WNK2之间存在负相关关系,与RAC1和MMP2之间存在正向相关关系。以CBX8不同表达情况的U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,使用MMP2活性检测试剂盒检测细胞系中和动物血清中RAC1和MMP2活性。结果显示:随着CBX8的逐渐升高,细胞系及动物血清中RAC1和MMP2的活性均有不同程度的升高,再次提示CBX8与RAC1和MMP2之间存在正向相关关系。以CBX8过表达的MDA-MB-231为研究对象,通过免疫共沉淀技术检测CBX8与WNK2之间的关系,结果显示,CBX8可与WNK2启动子区域结合,提示CBX8可以直接调控WNK2表达含量变化。6.以U251MG、MDA-MB-231和A549为研究对象,使用si RNA转染上述细胞,q RT-PCR检测WNK2表达情况,4组si RNA中选取WNK2降低最明显的2组(分别降低32.1%和46.5%),q RT-PCR检测RAC1和MMP2表达含量的变化。结果显示,RAC1和MMP2均有不同程度的降低,与CBX8差异性表达细胞系中表达含量变化一致,提示CBX8可通过WNK2调节RAC1和MMP2。结论:以上结果提示,CBX8在肿瘤组织中过表达并在部分肿瘤类型中影响预后。过表达的CBX8可以增加肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,进而增加远处转移的可能。以上肿瘤细胞生物学行为的变化主要是通过CBX8直接调控WNK2,进而调节RAC1和MMP2完成的。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2
【图文】：

蛋白结构

图 1：CBX 蛋白结构。% of identify：目的氨酸在总氨酸中的百分比； % of highconservation：高度保守氨酸数目在总氨酸数目中的比例（图片引用于 Ma RG, Zhang Y,Sun TT, et al. Epigenetic regulation by polycomb group complexes: focus on roles of CBX proteins. JZhejiang Univ Sci B. 2014; 15(5):412-28.）[9]。一般而言，CBX 蛋白可通过蛋白质结合域使组蛋白 H3 赖氨酸 27 三甲基化(H3K27me3)，进而募集 PRC1 其他成员到特定的染色质区域，抑制相关基因的表达。已有文献提示，不同 CBX 蛋白对不同的甲基化位点具有不同的亲和能力，如 CBX2、CBX7 均可诱导 H3K9me3 和 H3K27me3，而 CBX4 诱导 H3K9me3的能力较强。CBX 蛋白 C 端的多梳抑制框主要参与转录抑制或与其他 PRC1 组分进行结合，如 RING1B 等[10-12]。在 CBX2 中，染色质结合域附近存在 AT-hook区，而 CBX4，CBX6，CBX7，CBX8 中则存在 AT-hook 类似区。CBX 蛋白中间区域为非保守区域，可能与蛋白特异性结合靶基因有关[13,14]。目前发现，在不同物种间，同一物种不同细胞间，以及同一细胞的不同阶段，CBX 蛋白表达的种类、数量均不同。其赖以发挥功能的 PcG 蛋白复合体的组成

垂体,睾丸,博士学位论文,成纤维细胞

天津医科大学博士学位论文一、CBX8 在不同肿瘤类型中的表达情况及临床意义高，RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）分别为 4.62，3.12 和2.04。其余组织中表达情况基本相同，均为低表达（如图 1.1）。结合 TCGA 数据库数据发现，与正常组织相比，肿瘤组织中 CBX8 均有不同程度的升高（如图1.2）。

垂体,睾丸,成纤维细胞,表达水平

CBX8在瘤组和正常组中的表达情况：与正常组相比，瘤组中CBX8具有不同程度的升高

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