m6A去甲基化酶ALKBH5对胰腺癌恶性生物学行为的影响及机制的研究

发布时间：2020-08-08 15:45

【摘要】：目的:探索m6A去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌组织中的表达,及其与胰腺癌病理分级、临床分期和预后的相关性。方法:(1)采用免疫组化方法检测90对胰腺癌/正常胰腺的组织芯片中ALKBH5表达情况,分析ALKBH5表达与病理分级,临床分期和疾病预后的关系。(2)下载TCGA数据库中183例胰腺癌病例数据,分析ALKBH5在胰腺癌中的表达情况,分析ALKBH5表达与病理分级,临床分期和疾病预后的关系。(3)运用RT-PCR和Western-Blot方法检测ALKBH5在新鲜胰腺癌组织/正常胰腺组织中的表达情况。结果:(1)组织芯片免疫组化的结果显示,90例胰腺癌病例中ALKBH5的表达水平:62.2%(56/90)癌组织正常胰腺组织,22.2%(20/90)癌组织与正常胰腺组织中的表达量相当,仅15.6%(14/90)癌组织正常胰腺组织。统计分析示ALKBH5在癌组织中的表达量低于正常胰腺组织,p0.0001;分析TCGA数据,KRAS、CDKN2A、TP53或SMAD4等基因突变组中,ALKBH5的表达明显较未突变组低,且差异均具有统计学意义。WB检测结果显示:ALKBH5蛋白表达水平:癌组织正常胰腺组织,P0.05;RT-PCR检测结果显示:ALKBH5 m RNA表达水平:癌组织正常胰腺组织,P0.05。(2)根据AJCC病理分级恶性程度越高的病例,ALKBH5蛋白表达越低。胰腺癌TNM分期病程越晚期,ALKBH5蛋白表达越低。高表达组(N=46)中位生存期为25.5个月,五年生存率为40.5%,而低表达组(N=44)中位生存期为11个月,五年生存率为11.3%。低表达组生存期较高表达组短,P0.05。分析TCGA数据,结果示:高表达组(N=95)中位生存期为23个月,五年生存率为42.5%,低表达组(N=87)五年生存率为15.7%,中位生存期为18个月,低表达组生存期较高表达组短,p0.01。结论:ALKBH5在胰腺癌中低表达,且其表达水平与临床分期、病理分级及预后等负相关。此外,在胰腺癌组织中,胰腺癌发生关键基因KRAS、CDKN2A、TP53或SMAD4突变后ALKBH5的表达减少,ALKBH5表达减少可能与胰腺癌的发生发展相关。目的:探讨m6A去甲基化酶ALKBH5对胰腺癌的增殖和侵袭转移能力的影响。方法:(1)采用si RNA干扰技术、Crispr/cas9技术和慢病毒技术干预胰腺癌细胞系中ALKBH5的表达;(2)检测胰腺癌组织/正常胰腺组织中m RNA的m6A水平,干扰胰腺癌细胞中ALKBH5表达后,检测胰腺癌细胞m RNA的m6A水平;(3)体外采用CCK-8、克隆平板、划痕和Transwell等实验方法检测ALKBH5对胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响;(4)干预胰腺癌细胞中ALKBH5表达后,采用皮下成瘤模型和胰腺癌原位模型,研究体内ALKBH5对胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响。结果:(1)m6A的水平,癌组织癌旁组织,细胞中,ALKBH5下调组空白对照组,野生型ALKBH5上调组空白对照组,上调突变型ALKBH5(H204A)对m6A水平无影响。(2)体内外实验结果示,增殖和侵袭转移能力ALKBH5下调组空白对照组,野生ALKBH5上调组空白对照组,上调突变型ALKBH5(H204A)对增殖和侵袭转移能力无影响。(3)体内外实验证实,Crispr/cas9技术敲除ALKBH5表达后,细胞增殖侵袭转移能力增强。结论:ALKBH5在胰腺癌细胞中发挥抑癌作用,ALKBH5抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭转移,且对增殖侵袭转移的影响与其去甲基化酶功能相关。目的:探讨ALKBH5的上下游调控机制方法:(1)运用Oncomine、Gepia和c Bio Portal等公共数据库,分析TP53与ALKBH5表达的相关性;运用si RNA干扰、质粒过表达或crispr/cas9系统敲除等方法改变TP53表达后,研究ALKBH5的表达情况;构建ALKBH5启动子荧光报告素质粒,干扰TP53表达后,检测ALKBH5启动子活性的变化情况。(2)敲减ALKBH5后,进行Me RIP-seq和m RNA表达谱测序,分析Me RIP-seq中ALKBH5下调组特异peak对应的基因,以及m RNA表达谱测序中下调基因,寻找ALKBH5下游可能关键基因和通路。(3)运用WB、RT-PCR和荧光报告素试验,研究ALKBH5对APC/β-catenin/wnt通路的影响。(4)上调APC表达后,体外采用CCK-8、划痕和Tranwell等试验,检测APC对胰腺癌增殖和侵袭转移能力的影响。结果:(1)ALKBH5表达与野生型TP53表达正相关。野生型TP53促进ALKBH5的转录,突变型TP53无此功能。(2)Me RIP-seq结果:NC组富集到47647个peak,对应8147个基因,si ALKBH5组富集到49134个peak,对应8434个基因。其中,NC组特有6702个peak,对应2631个基因,si ALKBH5组有特有8192个peak对应3127个基因。m RNA表达谱测序结果:敲减ALKBH5之后,1361个基因改变明显,其中535个基因上调,826个基因下调。分析筛选出ALKBH5下游关键基因可能有RHOBTB2、TAF1、KSR1、APC、CDKN1A、WT1、HSF4等。RT-PCR验证结果显示,下调ALKBH5后APC减少最明显。(3)下调ALKBH5之后,APC的m RNA 3’-UTR区域稳定性降低,APC的m RNA及蛋白表达减少,β-catenin入核增加,TCF4/LEF与靶基因转录起始位点结合活性增强;上调野生型ALKBH5表达之后,APC的m RNA及蛋白表达增加,β-catenin入核减少,TCF4/LEF与靶基因转录起始位点结合活性减弱;过表达突变型ALKBH5则对APC/wnt/β-catenin/TCF4通路传导无影响。(4)上调APC可逆转ALKBH5下调所致的细胞增殖及侵袭转移增强。结论:胰腺癌中TP53突变导致促进ALKBH5转录的功能丧失,ALKBH5表达减少。APC/β-catenin/wnt通路增强,是ALKBH5低表达促进增殖和侵袭转移关键机制,ALKBH5/APC/β-catenin/wnt可能成为胰腺癌新的治疗靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9
【图文】：

组织芯片结果显示 ALKBH5 在胰腺癌中低表达，与生存预后临床指标负我们利用免疫组化检测胰腺癌组织芯片中 ALKBH5 表达情况，并结合临 ALKBH5 与胰腺癌病理分级、临床分期、预后生存的关系。ALKBH5 中均有分布，表达强度在 0-2.5 不等（如图 1.1）。

图 1.2 组织芯片临床数据分析结果 A. 潜水图，表达值求 log(2,T/NT) B. ALKBH5在癌组织和正常胰腺组织中的表达情况 C. 病理分级 D.临床分期 E. 生存期分析。1.4.2 TCGA 数据库分析结果显示，ALKBH5 低表达与 KRAS、CDKN2A、TP53 和SMAD4 等基因突变相关，且 ALKBH5 低表达组患者生存期更短。

图 1.3 TCGA 数据中 ALKBH5 表达与基因突变的关系 A. 183 例病例中 CDK2A、SMAD4、TP53、KRAS 等基因的突变组和未突变组 ALKBH5 的表达情况 B.ALKBH5多复制本组与单复制本组生存期分析 C.ALKBH5 缺失组与正常表达组生存期分析

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本文编号：2785767