负压创面疗法在铜绿假单胞菌感染创面中的应用及作用机制

发布时间：2020-08-09 03:08

【摘要】：背景创面感染是严重危害公共健康的感染性并发症之一。全国每年因此消耗的医疗费用高达百亿元。铜绿假单胞菌是创面感染的常见致病菌之一。早前研究发现:铜绿假单胞菌感染是细菌与机体相互作用及影响的复杂过程。其形成感染创面既与细菌定植的数量密切相关,同时又受细菌生物膜、细菌运动、毒素分泌以及毒力因子表达等因素的影响。负压创面疗法被认为是治疗和修复创面的有效方法。众多研究发现负压创面疗法治疗感染性创面可以起到减轻感染促进愈合的作用,但其具体机制目前尚不明确。我们的前期研究发现:应用负压创面疗法早期可以有效抑制相关毒力基因的表达、减少创面软组织内细菌毒素。而进一步深入探索负压创面疗法对铜绿假单胞菌相关毒力因素的影响有助于解释感染的控制理论,为临床医生治疗感染性创面提供理论依据和新的治疗思路。目的1.分析体外负压环境对铜绿假单胞菌运动范围、生物膜形成及毒素分泌的影响;2.通过建立在体模型探索负压创面疗法对细菌生物膜形态、生物膜成分及细菌侵袭深度的影响;3.分析负压创面疗法对感染创面pH值及免疫应答的影响;4.定量分析负压创面疗法对创面覆盖情况、表皮爬行、新生肉芽组织形成及血管生成的促进作用。方法1.建立体外负压环境下铜绿假单胞菌培养模型,通过直接测量、结晶紫染色、ELIS A(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)等方法分析负压对细菌运动能力、生物膜形成及毒素分泌的影响;2.建立负压创面疗法与常规无菌纱布覆盖治疗铜绿假单胞菌感染创面的兔耳和巴马香猪模型,通过冰冻切片、染色、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等方法探索负压创面疗法对细菌生物膜、生物膜成分及细菌在创面侵袭深度的影响;3.通过pH计测量、HE(Hematoxylin and eosin,HE)染色及实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)等方法分析负压创面疗法治疗下创面pH值及免疫应答变化情况;4.通过组织病理学、显微镜、Real-Time PCR等方法定量分析负压创面疗法和无菌纱布治疗铜绿假单胞菌感染创面的愈合情况。结果1.与常压环境相比,体外负压环境(-125mmHg和-200mmHg)可以抑制铜绿假单胞菌运动能力(涌动、群集运动、蹭行运动)、生物膜形成及毒素分泌;2.与常规纱布组相比,负压创面疗法可以提前将创面软组织内细菌降至临床感染标准(105 CFU/g组织)以下,在治疗的第16天(day17)时软组织内细菌计数平均已达102CFU/g(组织)以下;负压创面疗法治疗下软组织内细菌生物膜形成相对分散、细菌侵袭深度较常规纱布治疗浅,治疗的第16天时侵袭深度分别为18.2±9.7μm和40.0±12.3μm(P0.01);3.与常规纱布组相比,负压创面疗法组在治疗后创面平均pH值相对更低,感染早期负压创面疗法可以促进炎症因子IL-8的表达,激活炎症反应,同时抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的过度表达,可以抑制创面浅层中性粒细胞过度募集,起到避免持续过度炎症反应的双向调节作用;4.负压创面疗法治疗下创面新生表皮及肉芽组织明显多于常规纱布治疗组,创面愈合速度更快,两组巴马香猪软组织创面完全愈合时间分别为18.8±2.0天和23.5±2.7天(P0.01)。负压创面疗法组创面局部血管内皮生长因子(VEGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)表达水平更高,间接促进了创面愈合。结论负压作用可以有效抑制铜绿假单胞菌的运动能力、抑制细菌生物膜的形成及毒素分泌,尤其是-125mmHg和-200mmHg,但负压作用不能完全阻止细菌的毒力行为;与常规纱布治疗相比,负压创面疗法可改变创面细菌生物膜的状态,使其相对分散,减少创面生物膜的重要成分,这可能使细菌更加充分的暴露在机体免疫下,从而促进创面细菌的清除;负压创面疗法可有效促进感染创面早期炎症细胞及因子的调动,抑制创面过度炎症反应,降低感染创面过高的pH值,为创面愈合提供有利环境;负压创面疗法可以刺激创面生长因子的表达,促进创面表皮及肉芽组织的生长,在其治疗下创面愈合速度明显快于常规无菌纱布治疗。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R641
【图文】：

逦解放军医学院博士学位论文逦逡逑结果逡逑一、ＴＨＺ１对胰腺癌细胞增殖，凋亡，周期等的影响研宄逡逑１．不同胰腺癌细胞系中ＣＤＫ７表达水平逡逑我们选取了七种胰腺癌细胞系，在蛋白水平检测ＣＤＫ７的表达。结果如下图逡逑１－１，可见七种胰腺癌细胞系中蛋白水平普遍表达ＣＤＫ７。逡逑

图１－２胰腺癌细胞增殖曲线。细胞经不同浓度梯度的ＴＨＺｌ处理４８ｈ和７２ｈ，再由ＭＴＳ方法测量逡逑增殖状态，数据显示均数±标准差。逡逑表１邋ＴＨＺ１抑制胰腺癌细胞系增殖逡逑Ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅ逦ＩＣ５０邋（ｕＭ，邋４８ｈｏｕｒｓ）逦ＩＣ５０逦（ｕＭ，逦７２ｈｏｕｒｓ）逦逡逑ＣＡＰＡＮ２逦￣邋０．０３２逦￣邋０．０２５逦＾逡逑ＰＡＮＣ０３．２７逦０．０９１逦０．０５６逡逑ＰＡＮＣ０８．１３逦０．１８７逦０．１１５逡逑ＰＡＮＣ０２．０３逦０．１２２逦０．１０３逡逑ＰＡＮＣ邋１０．０５逦０．１３５逦０．０９３逡逑ＳＷ１９９０逦￣逦０．１８９逦０．１９５逡逑ＰＳＮ－１逦—逦０．１４４逦０．１９０逡逑ＨｕＰ－Ｔ３逦０．１２５逦０．１３０逡逑Ｈｓ７６６Ｔ逦—逦０．１７２逦０．１９８逡逑ＢｘＰｃ３逦０．１７７逦０．１０８逡逑

５．邋ＴＨＺ１对胰腺癌细胞凋亡相关蛋白及细胞周期相关蛋白表达的影响逡逑为进一步揭示ＴＨＺ１引发细胞凋亡和周期变化的机制，我们在蛋白水平进行逡逑了检测。结果如下图１－５，１－７所示，在ＣＡＰＡＮ２以及ＰＡＮＣ０３．２７两个细胞系中，逡逑ＴＨＺ１药物作用在相同时间Ｃ６ｈ），不同浓度处理（０，２０，１００，５００，邋２５００ｎＭ），逡逑调亡相关蛋白Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ明显增商，而周期相关蛋白ＣｙｃｌｉｎＨ表达水平未见逡逑明显变化。如图１－６，１－８所示，在相同ＴＨＺ１浓度（ｌＯＯｎＭ），处理不同时间（０，逡逑３，邋６，邋１２，邋２４ｈ）之后，我们也观察到，Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ蛋白水平明显增高，而Ｃｙｃｌｉｎ逡逑Ｈ表达水平未见明显变化。逡逑ＣＡＰＡＮ２邋（ＫＲＡＳ邋ｐ邋Ｇ１２Ｖ）逡逑ＴＨＺ－１邋（ｎＭ），邋６邋ｈｏｕｒ逡逑ＤＭＳＯ邋２０逦１００逦５００逦２５００逡逑逦逦＿ｒ邋？Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ逡逑？Ｃｙｃｌｉｎ邋Ｈ逡逑？ＧＡＰＤＨ逡逑图１－５不同浓度ＴＨＺｌ对ＣＡＰＡＮ２细胞Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ，邋ＣｙｃｌｉｎＨ蛋白水平的影响逡逑１６逡逑

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