miR-34在乳腺癌中对神经激肽1受体表达的调控研究

发布时间：2020-08-11 23:18

【摘要】：研究目的:探究乳腺癌组织及细胞中miR-34和神经激肽1受体(neurokinin1 receptor,NK1R)的表达,及miR-34和NK1R对乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响,希望为乳腺癌的防治提供新的证据。研究方法:1.临床组织标本及细胞系表达收集2013年2月~5月天津市肿瘤医院乳腺肿瘤科50例乳腺癌组织及癌旁组织标本,临床诊断均经病理学证实,其中浸润性导管癌46例、浸润性乳头状癌2例、髓样癌2例。TNM分期采用乳腺癌AJCC指南(第七版)的病理分期标准,其中乳腺癌I期14例、II期21例、III期15例。实时荧光定量PCR(realtime-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测乳腺癌组织及癌旁组织中miR-34b/c-5p及NK1R-Tr表达,统计学方法进一步分析其与乳腺癌病理资料的相关性。采用蛋白免疫印迹和RT-PCR实验检测乳腺癌细胞中NK1R的表达,RT-PCR检测miR-34的表达。2.miR-34对NK1R的表达调控生物信息学软件预测到miR-34与NK1R的3’UTR区存在结合位点。在乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞中分别过表达及降表达miR-34家族后检测NK1R的表达。构建神经激肽1受体-全长型(NK1R-full length,NK1R-FL)野生型质粒和NK1R-FL突变型质粒,分别与miR-34b/c-5p模拟物(mimic)及模拟物对照(mimic control)共同转染MDA-MB-231及HEK-293T细胞,检测荧光活性,探究miR-34-b/c-5p对NK1R-FL的调控作用。3.miR-34b/c-5p及NK1R对乳腺癌细胞功能的影响在MDA-MB-231及MCF-7细胞中分别过表达miR-34b/c-5p、使用NK1R拮抗剂和敲低NK1R后,采用CCK-8及克隆形成实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞增殖的影响。在MDA-MB-231细胞中改变miR-34b/c-5p及NK1R的表达水平后,采用划痕及Transwell小室实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞迁移侵袭的影响。4.miR-34b/c-5p及NK1R对乳腺癌细胞周期及凋亡的影响在MDA-MB-231及MCF-7细胞中分别过表达miR-34b/c-5p、使用NK1R拮抗剂和敲低NK1R后,采用流式细胞术及Annexin V/PI染色实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞周期及凋亡的影响。蛋白免疫印迹实验检测miR-34b/c-5p及NK1R对细胞周期相关蛋白的调控,检测Caspase-3酶活性探究miR-34b/c-5p及NK1R调控细胞凋亡的具体机制。5.TGF-β1、miR-34b/c-5p及NK1R间的相互表达调控使用不同浓度的TGF-β1在不同时间点处理MDA-MB-231及MCF-7细胞,检测miR-34b/c-5p及NK1R的表达水平。6.c-myc参与miR-34b/c-5p对神经激肽1受体-截短型(neurokinin1 receptortruncated,NK1R-Tr)的表达调控在MDA-MB-231及MCF-7细胞中敲低c-myc后过表达miR-34b/c-5p,检测NK1R-Tr的表达,探究miR-34b/c-5p对NK1R-Tr的调控机制。7.miR-34b/c-5p抑制乳腺癌细胞的成瘤能力在MDA-MB-231细胞中转染miR-34b/c-5p稳定激动剂(angimor)及相应的对照序列,3天后注射于裸鼠皮下。每周两次测量肿瘤的大小。27天后统一处死小鼠,取出肿瘤,测量大小,称其重量并将数据进行统计学分析。研究结果:1.乳腺癌组织及细胞中miR-34和NK1R表达乳腺癌组织中miR-34b/c-5p的表达水平显著低于癌旁组织(均P0.001),而NK1R-Tr的表达水平显著高于癌旁组织(P0.01)。在50例乳腺癌组织标本中,低水平miR-34b/c-5p和高水平NK1R-Tr与乳腺癌分期和Ki-67的水平密切相关,差异有统计学意义(均P0.05)。乳腺癌组织中miR-34b-5p和miR-34c-5p的相对表达量呈正相关(r=0.762,P0.001),miR-34b-5p和NK1R-Tr的相对表达量呈负相关,miR-34c-5p和NK1R-Tr的相对表达量呈负相关。在雌激素ER或孕激素PR阳性的乳腺癌组织中,NK1R-Tr的表达高于阴性患者(均P0.05)。HER-2阳性的乳腺癌组织中miR-34c-5p的表达量高于HER-2阴性的组织(P=0.006)。乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及T47D细胞中miR-34和NK1R-FL的表达水平低于SK-BR-3及HBL-100细胞,而NK1R-Tr的表达水平高于SK-BR-3及HBL-100细胞。2.miR-34b/c-5p负向调控NK1R在MDA-MB-231和MCF-7细胞中过表达miR-34b/c-5p后,NK1R-Tr和NK1R-FL的表达水平均下降(均P0.05);降表达miR-34b/c-5p后,NK1R-Tr和NK1R-FL的表达水平均上升(均P0.05)。而改变miR-34a和miR-34b/c-3p的表达水平,NK1R-Tr和NK1R-FL表达变化不明显(均P0.05)。在MDA-MB-231及HEK-293T细胞中,共同转染miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL野生型质粒与共同转染miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL-突变型质粒进行比较,荧光活性明显降低(均P0.05),而共同转染miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL-野生型质粒及miR-34b/c-5p mimic和NK1R-FL-突变型质粒进行比较,荧光活性无明显变化(均P0.05)。3.miR-34b/c-5p及NK1R对乳腺癌细胞功能影响在MDA-MB-231及MCF-7细胞中过表达miR-34b/c-5p及敲低NK1R可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移侵袭,并诱导凋亡,调控细胞周期相关蛋白表达,诱导细胞阻滞在G2/M期。与单独转染miR-34b/c-5p mimic进行比较,miR-34b/c-5p联合NK1R拮抗剂剂阿瑞匹坦(aprepitant)可明显抑制细胞增殖及凋亡能力(均P0.05)。4.c-myc参与miR-34b/c-5p对NK1R-Tr的表达调控在MDA-MB-231及MCF-7细胞中敲低c-myc并过表达miR-34b/c-5p后,与对照组相比,NK1R-Tr的表达量无明显变化。5.TGF-β1下调miR-34b/c-5p,而上调NK1R-Tr的表达。6.miR-34b/c-5p抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力转染miR-34b/c-5p angimor的裸鼠组与对照组进行比较,肿瘤的体积明显降低(均P0.05),重量也明显降低(均P0.05)。研究结论:在乳腺癌组织中,miR-34b/c-5p和NK1R-Tr的表达与乳腺癌进展密切相关,miR-34b/c-5p与NK1R-Tr的表达呈负相关。乳腺癌细胞中miR-34b/c-5p负向调控NK1R的表达。miR-34b/c-5p可结合于NK1R-FL的3’UTR区,而对NK1R-Tr的调控需要c-myc参与。miR-34b/c-5p可逆转TGF-β1对NK1R-Tr的表达调控作用。miR-34b/c-5p主要通过作用于NK1R-Tr抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭,诱导细胞阻滞在G2/M期,并诱导细胞凋亡。miR-34b/c-5p及NK1R可能成为乳腺癌新的治疗靶点。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

10图 1 miR-34 对 NK1R 的表达调控癌细胞中 miR-34 表达；B：乳腺癌细胞中 NK1R 表达；C：过表达 miR- 表达影响；D：降表达 miR-34 对 NK1R 表达影响；*P<0.05，**P<0.

检测乳腺癌组织及癌旁组织中 miR-34b/c-5p 及 NK1R-Tr 的表达水平发现，乳腺癌组织中 miR-34b/c-5p 表达量明显低于癌旁组织，而 NK1R-Tr 的表达量显著高于癌旁组织（均P<0.05，图3）。分析临床病理资料发现低水平的miR-34b/c-5p及高水平的 NK1R-Tr 与乳腺癌分期及 Ki-67 的表达有密切的相关性，发生淋巴结转移的乳腺癌患者组织中 NK1R-Tr 的表达量高于未发生转移者（P=0.026），而 miR-34b/c-5p 和 NK1R-Tr 的表达量与患者年龄无明显相关性(均 P>0.05)。另外发现在 ER、PR 阳性的乳腺癌组织中，NK1R-Tr 的表达量明显高于阴性患者（P=0.041，P=0.047），在 HER-2 阳性患者组织中，miR-34c-5p 的表达量低于阴性患者（P=0.006，表 1）。分析乳腺癌组织中 miR-34b/c-5p 和 NK1R-Tr 的表达相关性发现

图 4 miR-34b/c-5p 和 NK1R 调控细胞增殖K1R 敲低效果；B：CCK-8 实验检测 miR-34b/c-5p 和 NK1R 对细胞增殖的；C：克隆形成实验检测miR-34b/c-5p和NK1R对细胞增殖的影响；*P<0.05，0.012 miR-34b/c-5p 及 NK1R 对乳腺癌细胞周期及相关蛋白的影响观察到 miR-34b/c-5p 及 NK1R 对细胞增殖的显著影响，我们进一步采用流胞术检测 miR-34b/c-5p 和 NK1R 对细胞周期的影响。如图 5 所示，过表达34b/c-5p 及敲低 NK1R 可诱导细胞阻滞于 G2/M 期，且 miR-34b/c-5p 联合R 拮抗剂 aprepitant 可增强这一作用。在乳腺癌 MDA-MB-231 及 MCF-7 细过表达 miR-34b/c-5p 及敲低 NK1R 后检测细胞周期相关蛋白的表达量，发K 及 AKT 的磷酸化活性显著降低，但并不影响 ERK 及 AKT 本身的表达。 NK1R 后检测调节 G2/M 期的周期蛋白 cyclin B1 及 CDC23，发现其蛋白水 mRNA 水平均明显降低。过表达 miR-34b/c-5p 后仅 CDC23 的蛋白水平及A 水平有明显降低，而 cyclin B1 的表达无明显变化（均 P>0.05，图 8）。

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