BTK激酶抑制剂QL47的新靶点发现及作用机理研究

发布时间：2020-08-12 01:39

【摘要】：热休克蛋白是维持肿瘤细胞内稳态的重要组分,通过稳定多种导致癌症的原癌蛋白如激酶和转录因子的三维结构,从而平衡癌症细胞的内环境,促进癌症发生发展。靶向于热休克蛋白能够干扰其客户蛋白的结构,造成其不稳定进而被泛素化标记,最终经由蛋白酶体途径降解,从而达到抗肿瘤的目的。目前针对热休克蛋白抑制剂的研究多集中于HSP90和HSP70,多数的HSP90抑制剂结合于HSP90的N端结构域,通过与ATP竞争结合HSP90来发挥作用,但是这类抑制剂会引发HSF1转录因子激活,造成热休克家族蛋白的转录水平升高,这种负反馈会减弱HSP90打击肿瘤细胞的效果。HSP70作为HSP90的伴侣蛋白,参与体内新生蛋白的折叠,维持蛋白的结构稳定,同时HSP70还具有抗凋亡的作用,能够帮助癌症细胞抑制凋亡的发生。双重抑制诱导型的HSP70和持续表达的HSC70能够阻断HSP90的功能,导致原癌蛋白的降解,同时还可以诱导肿瘤细胞凋亡。基于此,开发新型HSP70抑制剂将为癌症的诊疗增加新的手段和策略,具有重要的研究意义。鉴于热休克蛋白与细胞内的多种蛋白,尤其是大量促进或驱动癌症的蛋白有相互作用,因此,建立基于HSP90的蛋白相互作用检测体系,能够检测热休克蛋白与客户蛋白之间的相互作用力,并表征小分子的结合强弱,可覆盖大部分在研的临床靶点,并且实现对一些无法开发生化检测手段的靶点进行检测。该体系的开发将有助于新药的研发和老药新用的筛选。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜的受体酪氨酸激酶,表皮生长因子Epidermal growth factor(EGF)与EGFR胞外区结合,导致其自磷酸化激活,并激活下游的信号通路。在我国致死率第一的恶性肿瘤是肺癌,非小细胞型肺癌约占我国肺癌发病率的80%,而在10%-35%的非小细胞肺癌患者中,会出现EGFR的突变,主要为19号外显子的缺失突变以及L858R点突变,这两种突变都会造成EGFR非依赖EGF的异常活化,持续驱动肿瘤的发生发展。针对EGFR活化的非小细胞肺癌,第一代的EGFR抑制剂吉非替尼,厄洛替尼的持续用药会诱发EGFR的T790M突变的产生,这种突变会导致患者对一代抑制剂产生耐药性。因此开发EGFR T790M的不可逆的高选择性抑制剂可以克服耐药性,为非小细胞肺癌患者提供新的用药选择。第一部分:BTK抑制剂QL47的新靶点发现QL47为激酶BTK的不可逆抑制剂,在进行高通量筛选的过程中,我们发现QL47在抗增殖实验筛选中对于FLT3-ITD突变型的AML细胞具有很强的效果,而我们之前的研究显示敲除BTK对于FLT3-ITD突变的细胞增殖没有明显的抑制作用,因此我们怀疑QL47具有其他的靶点,检测FLT3信号通路,我们发现FLT3-ITD在QL47作用下,蛋白发生降解,我们怀疑QL47是通过干扰了热休克蛋白辅助蛋白折叠的功能,影响了FLT3-ITD蛋白的稳定性导致其降解。我们利用47-Biotin探针发现QL47结合HSP70蛋白的N端结构域,通过LC-MS验证了 QL47不可逆结合于HSP70的C267位点。QL47能够影响HSP70的蛋白重折叠功能,但是对于HSP70的ATPase功能没有抑制,这表明QL47与HSP70的结合方式有别于传统的HSP70抑制剂VER155008,是一种新型的HSP70抑制剂。QL47作为新型的HSP70抑制剂,为今后的HSP70抑制剂的开发奠定了理论和结构基础,第二部分QL47针对FLT3突变白血病的抗肿瘤机制研究QL47抑制了FLT3突变的白血病细胞的机制主要是通过导致FLT3突变蛋白的降解,进而抑制下游的STAT5-MYC信号通路,从而体现了良好的FLT3突变的白血病细胞系的抗增殖效果。同时HSP70在肿瘤细胞内起到重要的抗凋亡作用,抑制了 HSP70能够导致抗凋亡因子XIAP的降解,进而导致细胞凋亡的发生,并且能够将细胞周期阻滞在G0-G,期。我们在BAF3-FLT3 mutant转基因细胞系上测试了QL47对于FLT3各种突变蛋白的影响,结果显示QL47不仅能够降解FLT3-ITD蛋白,并且对于各种激活突变以及耐药性突变也都有较强的降解作用比如N676D和F691L。最后,我们在原代病人细胞以及小鼠移植瘤模型上都观测到了QL47能够有效的抑制肿瘤的增殖。因此,QL47为FLT3-ITD突变的急性白血病的治疗提供了新的策略,并且在克服激酶耐药性方面具有很大的潜力。第三部分:基于HSP90的蛋白相互作用检测体系的建立评估药物与其靶点在生理环境中的相互作用是临床前药物研究中的需要面对的重要一环。鉴于HSP90在细胞中与多数激酶都有相互作用,并且稳定其结构,而小分子结合激酶后能够降低激酶与HSP90的结合。基于此原理,我们拟建立基于HSP90的蛋白相互作用检测体系,此体系以Split luciferase Complementation assay为基础,以荧光素酶的活性表征HSP90与激酶之间相互作用强弱,此体系能够覆盖多数与癌症相关的激酶靶点以及部分转录因子靶点,能够实现高通量筛选以发现有结合的小分子,并且能够对其结合力进行定量分析,是课题组已经建立的基于癌症激酶靶点的BaF3高通量细胞筛选库的补充和拓展,为高通量筛选提供了新的手段,能够提高老药新用以及新药筛选的效率。第四部分:EGFR选择性抑制剂CHMFL-EGFR-26的发现及研究研究团队在之前的研究中通过高通量筛选发现BTK激酶抑制剂依鲁替尼具有一定的EGFRT790M的抑制活性,以此结构为基础,研究团队对依鲁替尼的结构进行了优化,得到了靶向于外显子19的缺失突变,L858R点突变以及T790M突变型的EGFR不可逆抑制剂CHMFL-EGFR-26,该化合物采用一种新型的DFG-in-cHelix-out结合模式,在非小细胞肺癌肿瘤细胞系上的测试结果显示,CHMFL-EGFR-26在EGFR野生型及突变型细胞系之间取得了较好的选择性,在不影响EGFR野生型的情况下,能够有效抑制突变型细胞的增殖并且导致细胞凋亡的产生,同时小鼠模型实验结果显示,CHMFL-EGFR-26能够明显抑制两种EGFR驱动的非小细胞肺癌的移植瘤的生长。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

序列,结构示意图,分子伴侣蛋白,蛋白

，常的代谢和生存。同时ＨＳＰｓ在细胞信号转导，蛋白转运等方面也发挥作用。ＨＳＰ７０以及ＨＳＰ２７同时还与关键的凋亡因子有相互作用，在细胞亡的发生［２］。目前，研究的最为深入的热休克蛋白为ＨＳＰ９０。逡逑ＳＰ９０为依赖ＡＴＰ的分子伴侣蛋白，广泛存在于真核细胞中，与多种细胞有相互作用，并帮助稳定其三维结构，这类与ＨＳＰ９０有相互作用并依稳定其结构的蛋白称之为ＨＳＰ９０的客户蛋白。ＨＳＰ９０蛋白在进化中高度哺乳动物细胞中，ＨＳＰ９０可以划分ＨＳＰ９０Ａ，ＨＳＰ９０Ｂ以及ＴＲＡＰ三个家中研宄最为深入的是ＨＳＰ９０Ａ家族的蛋白，其编码基因表达两种ＨＳＰ９０９０ａ和ＨＳＰ９０ｐ邋），其中，ＨＳＰ９０ａ为诱导表达型，ＨＳＰ９０Ｐ在细胞中３］。ＨＳＰ９０ａ和ＨＳＰ９０ｐ在序列上有８５％的保守性，结构上分为三个结构构域（Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＮＴＤ），中部结构域（Ｍｉｄｄｌｅ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＭＤ）域（Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＣＴＤ）邋［４］（图１．邋１）。其中Ｎ－端结构域包含了邋Ａ点，用于ＨＳＰ９０结合ＡＴＰ，行使其ＡＴＰａｓｅ活性。中部结构域用于识别种客户蛋白以及分子伴侣蛋白，同时调控ＡＴＰａｓｅ的活性。而Ｃ末端结形成ＨＳＰ９０的二聚体［４］。逡逑７３２逡逑

热休克蛋白,图文,核酸,结构域

ｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＳＦ）调控，当细胞受到外界压力下，ＨＳＦ１激活，结合ＨＳＥ，促进ＨＳＰ７２逡逑的转录表达，帮助细胞应激，维持细胞内稳态［５］。逡逑ＨＳＰ７０家族蛋白保守型较高，ＨＳＰ７０的结构包括两个结构域（图１．３），Ｎ逡逑端的ＡＴＰａｓｅ结构域（ＡＢＤ）和Ｃ端的底物结合结构域（ＰＭ），其中ＰＢＤ含有ＥＥＶＤ逡逑ｍｏｔｉｆ，行使结合底物的功能和折叠功能，而Ｎ端的ＡＴＰａｓｅ结构域利用ＡＴＰ的水逡逑解循环为蛋白的折叠及释放提供能量［６］（图１．２）。逡逑３８５逡逑Ｎ逦ＡＴＰａｓｅ邋Ｄｏｍａｉｎ逦Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｄｏｍａｉｎ逦Ｌｉｄ逦Ｑ逡逑１逦５３７逦６３８逡逑Ｌｉｎｇｅｒ逡逑ｉ逦＾逦ｉ逦ｉ逦ｉ逡逑Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｄｏｍａｉｎ／逦Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｄｏｍａｉｎ逡逑ＡＴＰａｓｅ邋Ｄｏｍａｉｎ逡逑图１．２ＨＳＰ７０结构示意图逡逑图文来源（Ｂａｌｃｈｉｎ，ｅｔ邋ａｌ．邋２０１６）逡逑热休克蛋白ＨＳＰ４０以及核酸交换因子（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｅｘｃｈａｎｇｅ邋ｆａｃｔｏｒｓ，邋ＮＥＦｓ）逡逑严格调控ＨＳＰ７０的功能。ＨＳＰ４０能够识别并将底物转运给结合ＡＴＰ状态的ＨＳＰ７０，逡逑这种状态下的ＨＳＰ７０两个结构域之间的连接区与ＰＤＢ结构域的ａ－螺旋盖以及ＡＢＤ逡逑结构域相互靠近，ＰＤＢ结构域处于开放构像，使得客户蛋白易于和ＨＳＰ７０结合，逡逑在这种状态下与底物的结合和解离常数都较高，而ＨＳＰ４０与ＨＳＰ７０的结合能够大逡逑大促进ＡＴＰａｓｅ的酶活

示意图,热休克蛋白,图文,来源

ＨＳＰ７０，促进ＡＤＰ－ＡＴＰ进行交换，打开ＰＤＢ结构域的ａ－螺旋盖，释放完成折叠的逡逑底物，或者将其呈递给下游的ＨＳＰ９０进行折叠，或是进行泛素化标记经蛋白酶体逡逑途径发生降解（图１．３）。逡逑ＱＬｉＤ逦ｆｏｌｄｉｎｇ逡逑ｎａｔｉｖｅ逦ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ逡逑洕邋Ｈｓｐ７０逡逑ｏｔｈｅｒ逦ｈｉｇｈ邋ｋ0ｒ邋ａｎｄ邋ｋｏｆｆ逡逑ｃｈａｐｅｒｏｎｅ逦ｔ逦ｆｏｒ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ逡逑ｓｙｓｔｅｍｓ逦ＡＤＰ＾逦Ｉ逡逑Ｎ．邋ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ逡逑孤－？邋ｉ邋—逦ｙ逡逑Ｖ邋Ｊ邋ｌｏｗ邋ｋｏｒ，邋ａｎｄ逦Ｊ逡逑ｆｏｒ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ逦／逡逑＼逦ｃ邋ｏｐｅｙ逡逑图１．３ＨＳＰ７０／９０辅助蛋白折叠示意图逡逑图文来源（Ｂａｌｃｈｉｎ，邋ｅｔ邋ａｌ．邋２０１６）逡逑１．１．２热休克蛋白在癌症发生发展中发挥的作用逡逑目前研宄表明，热休克蛋白除了维持正常细胞的稳定外，在癌症细胞中，也逡逑发挥着重要的作用。相较于正常细胞，肿瘤细胞中的ＨＳＰ９０／７０通常处于过表达逡逑的状态，通过多种途径维持癌症细胞的发生和发展。逡逑在癌症细胞中，经常有过度活化或发生突变的原癌蛋白驱动肿瘤发生发展，逡逑而其三维结构通常是不稳定的，需要ＨＳＰ９０／７０的帮助，有文献报道，发生ＡＬＫ逡逑６逡逑

【相似文献】