天然小分子化合物Vibsanin A联合酪氨酸激酶抑制剂诱导急性髓系白血病细胞分化的作用与机制研究

发布时间：2020-08-12 15:55

【摘要】：研究背景和目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常见的造血系统肿瘤,增殖缺陷和分化受阻是导致白血病干细胞能过度增殖的两大原因。至今为止,大部分AML患者的治疗现状也不容乐观,即使能够通过化疗使病情完全缓解,复发的比率也仍然不容乐观。虽然ATRA用于诱导分化治疗AML取得了成功,但是ATRA诱导分化治疗仅对占AML 10%的APL(M3型AML)有效,而且还存在维甲酸综合征和维甲酸耐药两大缺陷,因此研究新的诱导分化剂也已经成为治疗AML研究的迫切需要。酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTK)的异常激活在AML发病进程中发挥重要作用,以PTK为靶点的药物研发和治疗方案已成为研究热点,许多酪氨酸蛋白激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)类抗肿瘤药物被报道具有脱靶效应(off-target),具有一定的白血病治疗作用。然而这些药物自身诱导AML细胞分化活性较弱,但是能协同ATRA诱导AML细胞分化。Vibsane型二萜化合物是荚醚属植物内提取的天然小分子化合物,存在80多种构型,具有鱼毒活性,被广泛报道具有抗肿瘤作用。我们前期研究发现Vibsanin A是一种新型的诱导分化剂,能显著诱导AML细胞分化,随后发现并确证了蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是其诱导白血病细胞分化的作用靶点,Vibsanin A通过激活PKC依赖的ERK/MAPK途径诱导AML细胞分化,研究还发现Vibsanin A能够协同酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化,本课题拟通过细胞分化模型筛选,发现酪氨酸激酶抑制剂协同Vibsanin A诱导AML细胞分化的最佳组合;深入研究PTK和PKC及其介导的信号转导通路,以期揭示酪氨酸激酶抑制联合Vibsanin A诱导AML细胞分化的分子机制,最终为诱导分化治疗AML提供新的治疗方案和药物靶点。研究方法1.利用流式细胞学检测细胞表面分化抗原CD11b的方法,筛选出一类可能具有诱导AML细胞分化作用的TKIs,并分别评估这些化合物联合Vibsanin A协同诱导AML细胞分化的活性。2.通过细胞形态学实验、细胞增殖抑制实验和细胞周期实验和周期蛋白检测进一步确定酪氨酸激酶抑制剂联合Vibsanin A诱导AML细胞分化的协同作用。3.利用经典PKC激动剂作为阳性对照药物,利用PKC信号分子抑制剂干预AML细胞分化,如GFX(PKC非选择性抑制剂)及GO6983(传统型和新型PKC抑制剂,抑制PKC-γ、ε、η、θ)等,观察它们对酪氨酸激酶靶向抗肿瘤药物联合FTC诱导的白血病细胞分化的作用,验证PKC途径是否参与协同诱导AML细胞分化。4.本部分研究重点以PKC下游与白血病细胞分化相关的信号转导通路如MAPK为主要研究对象,采用Western blot、免疫共沉淀等技术,观察通路中关键性信号分子磷酸化水平变化的时空效应,确定参与诱导AML细胞分化的PKC下游信号分子,并分析PKC与酪氨酸激酶调控的相互作用关系(协同或拮抗关键信号分子的激活效应)。5.靶向沉默或过表达技术对协同诱导AML细胞分化的关键信号分子进行验证。研究结果1.Vibsanin A联合TKIs诱导AML细胞分化。通过细胞表面分化抗原流式细胞学检测,我们发现一系列FDA批准于上市的TKIs在没有明显毒性的剂量下都能诱导HL-60细胞分化,大部分TKIs都能协同Vibsanin A诱导AML细胞分化,其中Imatinib和Sracatinib与Vibsanin A的协同作用最强。2.Vibsanin A能联合TKIs诱导AML细胞生长抑制和周期阻滞。Vibsanin A联合TKIs能够诱导AML细胞G1期细胞增加从而显著协同抑制细胞增殖。蛋白水平研究结果表明Vibsanin A能显著的联合TKIs上调周期蛋白P21和P27的表达,降低CDK4和CDK6的表达,并且抑制Rb蛋白的磷酸化。3.Vibsanin A联合TKIs通过PKC途径的激活诱导AML细胞分化。经典的PKC激动剂PMA与Vibsanin A有相似的协同TKIs诱导AML细胞分化的作用,广谱PKC抑制剂能够部分抑制TKIs联合Vibsanin A或TKIs单独诱导AML细胞分化。4.Vibsanin A联合TKIs上调Lyn蛋白的表达,从而诱导AML细胞分化。Y416位点是SRC家族激酶通用的磷酸化位点,研究结果表明Vibsanin A能增强SRC家族激酶Y416位点磷酸化,而TKIs则抑制该位点的磷酸化,但是TKIs单独均能均诱导SRC蛋白激酶家族中Lyn蛋白表达增加,并且与Vibsanin A上调Lyn蛋白表达的作用存在正向协同。对Lyn进行免疫沉淀后,发现Lyn的Y416位点磷酸化水平与其总蛋白的表达水平无关,为验证Lyn蛋白的上调在诱导AML细胞分化中的关键作用,我们构建了靶向沉默Lyn的慢病毒,发现靶向干扰Lyn能够抑制所有TKIs联合Vibsanin A诱导AML细胞分化的作用,在靶向干扰Lyn的同时抑制PKC途径则几乎完全阻断AML细胞分化。5.PKC和Lyn通过Raf/MEK/ERK信号通路联合诱导AML细胞分化。Vibsanin A能联合TKIs能增强ERK1/2、MEK、以及Raf-1的S338和S289/296/301位点的磷酸化的作用,并进一步抑制Raf活性抑制位点S259的磷酸化。Raf-1抑制剂Sorafenib和ERK1/2抑制剂U0126均能抑制联合诱导AML细胞分化,抑制PKC途径或者靶向沉默Lyn均能抑制Raf/MEK/ERK信号通路的激活。6.Vibsanin A联合TKIs下调c-Myc蛋白的表达诱导AML细胞分化。Vibsanin A联合TKIs用药后1h,实时荧光定量和Western blot检测到c-Myc蛋白在转录水平的下调和蛋白水平的降解,Raf-1抑制剂Sorafenib和ERK1/2抑制剂U0126能够减弱Vibsanin A联合TKIs诱导HL-60细胞内c-Myc蛋白下调的作用,阻断PKC途径和靶向沉默Lyn也能逆转c-Myc蛋白的表达,最后,我们建立过表达c-Myc的AML细胞株,发现过表达c-Myc能拮抗TKIs联合Vibsanin A诱导AML细胞分化的作用。研究结论1.研究发现天然小分子化合物Vibsanin A能够增强TKIs诱导AML分化的作用。2.Vibsanin A联合TKIs通过PKC途径和Lyn途径发挥协同诱导AML细胞分化的作用。3.Vibsanin A联合TKIs通过激活PKC和上调Lyn蛋白表达协同激活ERK/MAPK信号通路,增强对c-Myc的抑制作用,从而上调周期蛋白的表达使AML细胞周期阻滞,并协诱导AML细胞分化。4.Vibsanin A联合TKIs有望为AML或其他白血病治疗提供新的诱导分化治疗策略。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.7
【图文】：

细胞分化,专项课,珊瑚树,树叶

第一章天然小分子化合物 Vibsanin A 联合酪氨酸激酶抑制剂诱导AML 细胞分化效应研究本课题前期研究在国家“重大新药创制”专项课题《天然活性成分 Vibsanin A靶向 PKC 诱导分化治疗白血病的候选药物研究》（课题编号：2009ZX09103-406；2009-2010）资助下从早禾树树叶中提取了大量的天然 Vibsanin 型二萜化合物，发现其中 Vibsanin A 是一个具有潜力的诱导分化剂(如下图所示)，能够诱导白血病细胞分化、抑制白血病细胞增殖，进而降低白血病细胞的成瘤性，发现并确证了蛋白激酶 C（PKC）是其诱导白血病细胞分化的作用靶点，分子机制研究结果揭示PKC/ERK通路参与Vibsanin A诱导的白血病细胞分化，表明小分子化合物VibsaninA 是一个有前景的靶向 PKC 诱导分化治疗白血病的候选药物。

活性筛选,HL-60细胞

图 1.2 TKIs 诱导 HL-60 细胞分化活性筛选Imatinb(IMA)与 Saracatinib(SAR) (5、10、20μM)； Bosutinib(BOSU)（1.25、2.5、5 μM）；Dasatinib(DASA) 、Gefitinib(GEFI)、Erlotinib(ERLO)与 Nilotinib(NILO)（2.5、5、10μM）联合诱导 HL-60 细胞 72h 后经流式细胞仪检测 CD11b 的表达。图中数据采用均值±标准差表示，n=3，各剂量药物处理组与 DMSO 对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Student t检验分析数据显著性差异。1.3.2 TKIs 协同 Vibsanin A 诱导 HL-60 细胞分化活性筛选天然小分子化合物 Vibsanin A0.1μM 剂量单独诱导 HL-60 细胞 CD11b 表面标记的表达率为 13.3±1.9%，故采用该剂量（0.1μM）用于联合酪氨酸激酶抑制剂诱导 AML 细胞分化研究（图 1.3A）。流式细胞学检测结果表明（图 1.3B）：大部分酪氨酸激酶抑制剂均能联合低剂量 Vibsanin A 显著增强诱导急性髓系白血病细胞HL-60 的分化效应，其中 Saracatinib、Imatinib10μM 剂量下联合 Vibsanin A0.1μM诱导HL-60细胞CD11b表达率分别从21.9%和29.5%提升至75.1%和87.3%；EGFR抑制剂 Erlotinib、Gefitinib 单独几乎不诱导 HL-60 细胞 CD11b 表达，联合 VibsaninA 却可将 CD11b 的表达率分别从 2.99%和 2.29%提高至 52.6 和 56.7%；Dasatinib

HL-60细胞,协同诱导,细胞分化,用药剂量

Dasatinib（5μM）和 Nilotinib（10μM）联合 Vibsanin A (0.1 μM)诱导 HL-60 细胞分化 3d 后经流式细胞仪检测 CD11b 的表达（B）。综合评估各抑制剂增强 Vibsanin A 诱导 AML 细胞分化能力（C），图中数据采用均值±标准差表示，n=3， *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 与对DMSO 对照组相比（Student t 检验）；## P < 0.01, ### P < 0.001 表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-way ANOVA），& P < 0.05 与 Vibsanin A 组相比（Studentt 检验）。1.3.3 Vibsanin A 协同 TKIs 诱导 HL-60 细胞分化的量效关系梯度浓度（ Imatinib 或 Saracatinib 联合相应固定剂量比的 Vibsanin A（Imatinib/Saracatinib: VibsaninA=100：1）处理 HL-60 细胞 72h，经流式细胞学检测 CD11b 表达，并根据 Chou-Talalay 联合指数法[32]，计算药物联用的 CI 值。结果表明 Imatinib（图 1.4A、B）或 Saracatinib（图 1.4C、D）联合 VibsaninA 诱导 HL-60细胞 CD11b 表达的 CI 值均小于 1，具有显著的正向协同诱导 AML 细胞分化的作用，当 Imatinib 或 Saracatinib 用药剂量为 10μM，联合 VibsaninA0.1μM 的情况下，CI 值均小于 0.01（分别为 0.009 和 0.002），表明在该剂量下，Imatinib 或 Saracatinib与 VibsaninA 具有极强的协同诱导分化作用。A B

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