介孔二氧化硅纳米微粒共转运Doxorubicin和MDR1-siRNA治疗耐药口腔鳞状细胞癌的研究

发布时间：2020-08-19 15:57

【摘要】：目的：考察介孔二氧化硅纳米微粒(Mesoporous silica nanoparticle，MSNP）共转运体系逆转肿瘤多药耐药、杀伤肿瘤细胞的效果，证实阿霉素（Doxorubicin，DOX）与MDR1-siRNA共同应用具有协同抗肿瘤作用，并初步探索自噬在杀伤肿瘤细胞过程中的作用。 方法：首先采用溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米粒子，通过表面修饰阳离子聚合物聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）使其带有正电荷，能够与带负电的MDR1-siRNA相结合，同时将抗肿瘤药物DOX吸附于介孔内部，形成载药、载基因的共转运体系。采用透射电镜观察粒子形貌、动态光散射测得粒子电势，利用紫外可见分光光度法测定载药量和药物释放曲线；通过MTT法测定DOX对口腔鳞癌细胞株KB及耐药株KBV的半抑制浓度IC50；使用荧光显微镜、流式细胞仪测定转染效率。体外通过Real-Time PCR技术检测MDR1基因的表达水平；AnnexinV-FITC/7-AAD双染法经流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Western Blot检测凋亡及自噬相关蛋白的表达水平。体内建立裸鼠荷瘤模型，进一步验证介孔二氧化硅纳米微粒共转运体系治疗耐药口腔鳞状细胞癌的效果。 结果：透射电镜下观察所合成的粒子尺寸为80-100nm，表面介孔直径约3-5nm，分散性较好，尺寸均一；紫外法测得粒子的载药量为18.5%，药物的释放速率初期较快，10h释放达30%，随时间延长速率减慢，120h累积释放达70%以上；紫外法测得IC50(KB-DOX)=182.9ng/ml、 IC50(KBV-DOX)=9233.5ng/ml，计算KBV的耐药倍数为50.483871倍；荧光显微镜、流式细胞仪测得pEGFP和siRNAFAM转染效率分别为6.73%、32.44%；Real-Time PCR结果提示：与空白对照组相比，MDR1-siRNA能够显著下调MDR1mRNA水平；AnnexinV-FITC/7-AAD双染法经流式细胞仪测得单纯载药、单纯载基因组细胞凋亡率分别为12.74%、10.08%，双载组细胞凋亡率为25.68%；体内实验结果显示单纯载药组抑瘤率为58.67%，双载组抑瘤率达81.64%；Western Blot检测发现，双载组自噬相关蛋白Beclin1和LC3水平明显上调，而P62蛋白表达下降，提示细胞自噬的发生。 结论：介孔二氧化硅纳米微粒共转运体系能够有效逆转肿瘤多药耐药、杀伤肿瘤细胞；与单纯载药、载基因组相比，同时应用DOX与MDR1-siRNA具有协同抗肿瘤作用；并且在共转运体系治疗耐药口腔癌的过程中，自噬可能起到重要的作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【图文】：

第 2 章 MSNP-PEI/基因复合物的制备与表征板的每孔中接30×104个KBV细胞，培养24h。制备w/w分别为、20：1的MSNP-PEI/pEGFP复合物，EGFP质粒为2.5μg。转染成无血清培养基，加入材料与质粒的复合物，4h后换完全培1的PEI/pEGFP作为阳性对照组。48h后利用荧光显微镜观察并通过流式细胞仪测定转染效率。扩增鉴定后的质粒经 Nanodrop 2000 测得 OD260nm：OD280nm=1.8～A 纯度较高，无蛋白质和 RNA 污染，pEGFP 浓度为 447.2ng/90.1ng/μl。质粒经 EcoR I、Hind III 酶切鉴定结果如图 2.1 所

图 2.1 质粒 pGFP-V-RS shRNA 图谱及酶切鉴定结果2.2.2 透射电镜利用PEI和MSNP之间静电作用得到MSNP-PEI纳米复合物。图2.2A、B分别为合成的MSNP、MSNP-PEI透射电镜图片，可以观察到MSNP、MSNP-PEI粒子形态规则，呈球形，粒径分布在80-100nm之间，粒子表面有直径为3-5nm的介孔。图2.2 透射电镜(TEM)图片：(A) MSNP；(B) MSNP-PEI

复合物的平均粒径为170.5±3.8nm，均较干燥后的势为-24.3±2.7mV，与PEI复合后MSNP-PEI的电势基因相结合。表2.2 粒径和电势Average particle size (nm) Ze150.4±6.9 12.9±0.7 170.5±3.8 阻滞实验SNP-PEI 与质粒的结合情况，进行 DNA 凝胶阻滞MSNP-PEI 与质粒的 w/w 达到 10：1 时不再有 DN到 10：1 时，MSNP-PEI 能够与质粒 DNA 完全结

【共引文献】

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本文编号：2797282