乏氧微环境中RNF139参与胰腺癌抗凋亡机制的研究

发布时间：2020-08-19 18:03

【摘要】：背景RNF139(Ring Finger Protein 139),是一个含有Ring-H2的多次跨膜蛋白。该蛋白定位于内质网,拥有泛素连接酶的活性。最近一项非小细胞肺癌对白蛋白紫杉醇的耐药组学研究中发现RNF139在白蛋白紫杉醇耐药的肿瘤细胞系中的蛋白水平表达显著升高。白蛋白紫杉醇作为目前胰腺癌客观缓解率最高的化疗药物,其效果不好一直是困扰临床的主要问题,因此我们设想RNF139在胰腺癌中是否会通过某些抗凋亡的相关分子机制导致肿瘤细胞对白蛋白紫杉醇产生敏感性,且目前在胰腺癌中尚未有关于RNF139的任何报道。通过预实验结果以及在线数据库分析,我们发现与胰腺组织相比,胰腺导管腺癌患者的手术标本中RNF139的mRNA水平以及蛋白水平表达量明显升高;与正常胰腺导管细胞系相比,胰腺癌细胞系中的RNF139的表达也明显上调;RNF139与细胞凋亡相关基因呈明显正相关。乏氧环境下,胰腺癌细胞系中RNF139的表达量明显上调。从而,我们进一步设计实验探索在胰腺癌中RNF139表达升高与患者的生存、预后以及各个临床病理学参数的关系,以及RNF139在胰腺癌抗凋亡中的作用和调控机制,目的是从临床水平、分子生物学水平、细胞水平及动物实验水平等不同研究层次深入探索乏氧环境下胰腺导管腺癌中RNF139参与胰腺癌抗凋亡以及RNF139可能对乏氧的反馈调节的临床意义与分子机制,为寻求新的胰腺癌治疗靶点提供理论依据和应用基础。方法1.进一步收集胰腺导管腺癌患者的组织石蜡标本扩大研究样本量,进行连续切片,对HIF-1α及RNF139进行共定位免疫组化染色,之后从组织蛋白表达水平来统计两者之间表达量的相关性,同时结合患者的临床病理学参数综合分析RNF139表达水平与各个临床病理参数之间的关系。2.应用免疫印迹试验(Western Blot,WB)、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)等技术检测胰腺癌细胞系以及正常胰腺导管细胞系中RNF139及HIF-1α的mRNA以及蛋白水平的表达量并分析其相关性;采用免疫荧光技术检测RNF139在胰腺癌细胞中的细胞定位。3.应用分子克隆方法构建RNF139、HIF-1α过表达质粒以及RNF139、HIF-1α的shRNA降表达质粒,建立稳定转染细胞系;用WB、RT-qPCR及检测所构建稳系RNF139及HIF-1α表达水平。4.应用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)、流式细胞术等实验方法检测上述构建的稳定转染细胞系的凋亡比例。应用瞬时转染技术,在过表达HIF-1α的稳转细胞系瞬时转染RNF139的siRNA并检测其凋亡比例的变化;在降表达HIF-1α的稳转细胞系中瞬时转染过表达RNF139的质粒,并比较其凋亡比例的变化。5.应用WB、RT-qPCR等检测RNF139稳转细胞系中VHL及HIF-1α的表达水平。在降表达RNF139的稳转细胞系中瞬时转染VHL的过表达质粒、在过表达RNF139的稳转细胞系中瞬时转染降表达VHL的siRNA并比较其凋亡比例的变化。6.利用NOD-SCID小鼠构建胰腺癌皮下成瘤模型,记录皮下肿瘤生长曲线。3周后取瘤体,体内验证RNF139对胰腺癌抗凋亡的影响。结果1.我们对搜集的115例手术标本进行了临床相关性分析,并从其中随机抽取8例成对标本进行RT-qPCR检测发现,与配对的胰腺正常组织相比RNF139在胰腺癌组织中呈高表达水平,且RNF139的高表达与胰腺癌患者的总生存预后呈负相关,差异具有统计学意义(P0.05);分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库的数据作为验证队列,结果一致。2.应用分子克隆技术,分别构建过表达RNF139稳转细胞系两株(SW1990-pLV-RNF139、MIA PaCa2-pLV-RNF139)和降表达RNF139稳转细胞系两株(SW1990-pLV-ShRNF139、MIA PaCa-2-pLV-ShRNF139),经白蛋白紫杉醇处理后采用流式细胞术以及TUNEL检测对照组以及稳转细胞系,发现过表达RNF139组凋亡比例显著降低,降表达RNF139组凋亡比例显著升高。WB检测凋亡相关蛋白发现,Caspase-12、Caspase-3等显著改变。用各对照组及稳转细胞系在裸鼠皮下构建皮下成瘤模型,发现与对照组相比降表达RNF139组肿瘤体积显著减小;进一步研究证实,降表达RNF139组凋亡比例显著升高。3.通过数据库分析以及文献提示,RNF139定位于内质网,该家族成员可影响细胞的内质网应激。采用WB技术检测瞬转过表达及降表达RNF139胰腺癌细胞系发现,内质网应激相关的蛋白eIF2α、CHOP等改变明显,即RNF139可通过影响胰腺癌细胞的内质网应激来影响胰腺癌细胞的凋亡。4.胰腺癌细胞经乏氧处理后,RNF139在mRNA水平及蛋白水平显著上调。在组织水平、细胞水平,HIF-1α与RNF139的表达具有一致性。数据库分析发现RNF139的启动子区有HIF-1α的特异性结合位点。染色质免疫共沉淀实验以及双荧光素酶报告系统发现,HIF-1α可与RNF139启动子区的低氧反应元件结合并启始其转录。结果表明,RNF139是HIF-1的直接转录调控靶点。5.WB检测发现,过表达RNF139的稳转细胞系中,HIF-1α显著上调,VHL表达显著下调;RNF139降表达细胞系中,HIF-1α显著下调,VHL表达显著上调。在降表达RNF139的稳转细胞系中瞬时转染VHL的siRNA,并用WB检测发现RNF139没有显著改变,HIF-1α表达量显著上调。以上结果表明,RNF139可以通过VHL途径影响HIF-1α的降解。6.RNF139是HIF-1在胰腺癌中发挥其抗凋亡作用的重要途径之一。通过检测过表达HIF-1α的稳定转染细胞系及过表达HIF-1α后瞬时转染降表达RNF139的细胞系的凋亡发现,相较于前者,后者的凋亡比例明显增加。结论1.RNF139在胰腺癌中表达升高,并且RNF139的高表达具有重要的临床意义2.RNF139可通过影响胰腺癌细胞内质网应激来参与胰腺癌细胞的抗凋亡3.HIF-1α可通过转录调控RNF139的表达从而影响胰腺癌的凋亡;HIF-1α的表达与白蛋白紫杉醇的治疗效果相关4.RNF139可通过减少VHL的表达来上调HIF-1α的表达从而形成正反馈环路
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9
【图文】：

正常组织,胰腺癌,病例,年龄

总生存的 Kaplan-Meier 曲线分析；用卡方检验分析 RNF139 蛋白表达水平与临床病理参数之间的相关性；Cox 比例风险回归模型用于多变量分析评估影响胰腺癌患者预后的独立危险因素。P值小于 0.05 时被认为是有统计学意义的。1.2 结果1.2.1 115 例胰腺腺癌患者基本信息在 123 例 PDAC 中，排除了 8 例非肿瘤致死病例，剩余病例 115 例。其中男性 65人、女性 50 人。年龄<65 岁 80人，年龄≥65 岁 35人。123例病例中，22 例有淋巴结转移；外周血管侵犯 38 例；高分化 9 例，中分化 64 例，低分化34 例；I-II 期 82 例、III 期 23 例。43 例肿瘤的最大直径≤2 cm。1.2.2RNF139 在胰腺癌组织标本中的表达RNF139 位于细胞浆里内质网上。分析组化染色结果发现，RNF139 在胰腺导管腺癌中的表达水平较正常组织显著升高（图 1.1）。在新鲜的癌和癌旁配对组织的 mRNA 水平表达量也证实了 RNF139 在胰腺癌中的高表达（图 1.2）

胰腺癌,临床病理学,表达水平,病理学

9 在胰腺癌及癌旁配对组织中 mRNA水平的表水平与临床病理学参数之间的关系医师的评分，我们将筛选出的 115例 PDAC低表达组。各病理学参数也分为两组，再将数进行统计分析，各临床数据与 RNF139 的分析，可发现肿瘤大小、pT 分期以及一二站淋平相关，差异均具有统计学意义（P<0.05）管腺癌中 RNF139 表达水平与临床病理学参例数RNF139 表达水平低高 82 62 3023 10 13性结阳性）

硕士学位论文,数据库,患者,方法

学硕士学位论文一、RNF139 在胰腺导管腺癌组织中高表达著缩短。我们使用同样的方法在 TCGA数据库中进行了验即 RNF139 低表达组患者的生存期显著优于 RNF139 高表

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