乳腺肿瘤细胞HSP70功能及其抑制剂诱导细胞凋亡的光学测量

发布时间：2020-08-19 18:36

【摘要】：热休克蛋白70(Heat shock 70,HSP70)与乳腺肿瘤形成、发展、治疗、预后和肿瘤治疗中形成的药物抵抗有关,从而成为抗肿瘤治疗的新靶点。本论文通过热休克(HS),即高热(43℃)作用来诱导乳腺肿瘤细胞内HSP70表达增强,通过HSP70抑制剂VER-155008来抑制乳腺肿瘤细胞内HSP70的功能,采用MTT法研究HSP70功能对细胞增殖的影响。采用激光扫描共聚焦显微成像技术和双光子荧光显微成像技术研究HSP70功能对乳腺肿瘤细胞中反映细胞代谢状态的线粒体膜电位、NADH和FAD荧光强度以及氧化还原比率(RR)的影响。首先,使用BCA蛋白质定量试剂盒和人HSP70的ELISA检测试剂盒检测MCF-7和MDB-MA-23 1乳腺肿瘤细胞在HS作用前和HS作用后细胞中的HSP70含量的变化。利用MTT法测量了乳腺细胞MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A在单独HS作用(43℃)、单独HSP70抑制剂VER-155008作用以及HS和VER-155008联合作用下乳腺细胞的增殖情况。结果表明三种乳腺细胞的高热耐受能力存在明显差异,从高到低依次为MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231。HS对细胞促增殖效应和增殖抑制效应与细胞种类和HS作用时长(1h、2h和3h)有关。HSP70功能抑制导致三种乳腺细胞的增殖均受到抑制,且其抑制效果呈现剂量相关性和作用时间依赖性;细胞在联合作用下的增殖情况是单独HS作用效果及单独VER-155008作用效果的综合。其次,应用激光扫描共聚焦显微成像技术和线粒体膜电位荧光探针JC-1可视化和量化了乳腺肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231在单独HS作用(1h)、单独VER-155008作用和两者联合作用开始后的24h、48h和72h下的线粒体形态结构、线粒体膜电位、含量及细胞尺寸的变化情况。结果表明,在三个测量时间下,对照组细胞和单独HS作用下的细胞线粒体网络完整,形态舒展,覆盖了细胞内的大部分区域。线粒体的膜电位、含量和细胞尺寸与对照组细胞相比没有统计差异;单独VER-155008作用和联合作用导致线粒体网络破坏,线粒体膜电位、含量和细胞尺寸减小,出现了与细胞早期凋亡相似的现象,但联合作用下的线粒体膜电位、含量和细胞尺寸减小的幅度小于单独VER-155008作用减小的幅度。这预示着HSP70抑制诱导乳腺肿瘤细胞凋亡,但HS作用减轻了其促凋亡效果。最后,细胞内的自体荧光NADH和FAD是细胞氧化还原呼吸链上重要的辅酶,可作为灵敏的内源性含氧指标来反映机体的代谢状态和细胞活力。采用构建的活细胞代谢光学测量系统监测了乳腺肿瘤细胞MCF-7和MDA-MB-231在分别HS作用1h、2h和3h后,细胞内与代谢紧密相关的NADH、FAD荧光强度和氧化还原比率的动态变化。并且,测量了HS作用、VER-155008作用、他莫昔芬作用以及两两联合作用对乳腺肿瘤细胞内NADH、FAD和氧化还原比率的影响。所得的结论揭示了细胞代谢变化与HS作用后的乳腺肿瘤细胞的促增殖及增殖抑制间的关系,并进一步明确了靶向HSP70在抗乳腺肿瘤治疗中的重大意义。基于双光子荧光显微成像的氧化还原比率可用于抗肿瘤治疗的疗效监测、药物筛选和治疗方案优化。
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

激光扫描共聚焦显微镜,简化原理

约在ｌ（ｒ４９ＣＷ＾。而且，对于单光子激发显微成像，荧光激发区域在整个入射光束行逡逑经的路径上，而双光子激发成像，荧光激发区域仅在焦点附近很小的区域内产生（如逡逑图２．１所示）。逡逑２．２．２．２激光扫描共聚焦显微镜原理逡逑基光扫描共聚焦显微镜主要包括激光光源、扫描装置、出射小孔、光探测器、逡逑光学显微镜和信号处理系统等几个组成部分。该显微镜基于共轭焦点技术设计而成，逡逑使激光光源、被测样品和探测器处于彼此的共轭位置上。其成像原理如图２．２所示：逡逑Ｄｅｔｅｃｔｏｒ邋Ｊ逡逑Ｐｉｎｈｏｌｅ逡逑Ｌａｓｃｒ邋，逡逑ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ逡逑１ｆｔ逡逑ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＣＴ＾逡逑＼ｆ逡逑Ｆｏｃａｌ逡逑图２．２激光扫描共聚焦显微镜简化原理图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｃｏｎｆｏｃａｌ邋ｌａｓｅｒ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ逡逑激发光被二向色镜（Ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃｍｉｒｒｏｒ，ＤＭ）反射后，经显微物镜聚焦到待测样逡逑品上。样品产生的荧光和少量反射激光，经物镜重新收集后到达ＤＭ。其中比激发逡逑光波长更长的荧光信号经ＤＭ和出射小孔后，被探测器收集，而少量的残余激发光逡逑和离焦荧光信号则分别被ＤＭ和出射小孔阻挡无法到达探测器。之后，将探测器收逡逑集到的荧光信号转化为电信号并送入计算机进行处理。逡逑激光共聚焦扫描显微技术是一种高分辨率的显微成像技术。在对生物组织和细逡逑胞进行测量时，由于出射小孔的存在，基本上杜绝了来自焦点邻近区域的离焦荧光逡逑对成像的千扰

双光子荧光,简化原理,显微镜

物镜的焦点处的光子密度最高，双光子激发荧光均来自于物镜的焦点上，所以逡逑双光子显微镜不需要共聚焦针孔来滤除离焦荧光，提高了荧光检测效率。其原理如逡逑图２．３所示：逡逑Ｄｅｔｅｃｔｏｒ逡逑Ｕ逡逑Ｌａｓｅｒ邋今邋Ｕ逡逑Ｉ逦Ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ逡逑？４逡逑图２．３双光子荧光显微镜简化原理图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ逡逑双光子荧光显微镜由于其独特的荧光激发方式，与共聚焦扫描显微镜相比，具逡逑－１７－逡逑

激光扫描共聚焦显微镜,实物

逡逑图２．４飞秒激光器实物图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｐｈｏｔｏ邋ｏｆ邋ｆｓ邋ｌａｓｅｒ逡逑２．３．２激光扫描共聚焦显微成像系统逡逑本文采用ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８邋（Ｇｅｒｍａｎｙ）激光扫描共聚焦显微镜进行实验。该显微逡逑镜为倒置荧光显微镜，具备明场、荧光、微分千涉等成像功能。其配置多个高倍、逡逑高ＮＡ共聚焦专用复消色差物镜，内置的固体激光器提供４８８ｎｍ和５５２ｎｍ波长选择，逡逑包含ＰＭＴ、ＡＰＤ、ＨｙＤ等多个探测器，其中ＨｙＤ为超高灵敏度磷砷化镓检测器。逡逑显微镜通过棱镜分光，可检测荧光波长范围为４００－８００ｍｎ。该显微镜有一个外输入逡逑口（右图中矩形框内），我们通过外部光路将飞秒激光导入到仪器内部，实现双光逡逑子荧光成像。该仪器实物如图２．５所示：逡逑ｌ．邋％逡逑图２．５激光扫描共聚焦显微镜实物图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．５邋Ｐｈｏｔｏ邋ｏｆ邋ｌａｓｅｒ邋ｓｃａ

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