Yes相关蛋白1在膀胱癌发生发展中的作用及其机制研究

发布时间：2020-08-29 09:13

　　目的:膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤,复发率高,多数患者死于不同程度的膀胱肿瘤转移与复发,对该肿瘤的研究引起国内外学者的广泛关注。Yes相关蛋白1(Yes-associated protein1,YAP1)作为癌基因,在抑制细胞凋亡、丧失细胞接触抑制、促进细胞异常增殖及细胞恶性转化等方面发挥重要作用。目前在多种肿瘤组织中发现YAP1呈高表达状态,并被认为有望成为肿瘤早期诊断的分子标志物及肿瘤治疗的潜在靶点,但其对膀胱癌细胞的作用研究文献报道尚较少。因此本研究拟观察YAP1在膀胱癌发生发展中的作用,并探讨其作用机制。方法:采用真核转录质粒pGreenPuro构建针对YAP1基因的重组转染质粒。将4种不同序列的YAP1 shRNA质粒以及含与YAP1无关序列的YAP1 shRNA NC分别转染T24细胞,48 h后qPCR检测其YAP1表达水平,筛选YAP1基因沉默效果最好的shRNA质粒干预T24细胞;使用MTT检测shRNA质粒对T24细胞增殖能力的影响、划痕实验检测其对迁移能力的影响、Transwell小室体外侵袭实验检测侵袭能力的影响。18只裸鼠构建人膀胱癌裸鼠动物模型,然后分为 3 组:YAP1 shRNA3-pGreenPuro 组、Control-shRNA 组与生理盐水组,每组6只。YAP1 shRNA3-pGreenPuro组肿瘤体内分别多点注射YAP1 shRNA3-pGreenPuro重组质粒,每只分别为50μg质粒+400 μl 5%琼脂糖+10 μl转染试剂(转染试剂配制参见说明书),ControlshRNA组和生理盐水组分别为50μg阴性对照质粒和50 μl灭菌生理盐水。比较各组荷瘤裸鼠一般情况、毒副作用、抑瘤率,光学显微镜下观察各组肿瘤组织病理学,采用RT-PCR法检测各组肿瘤组织YAP1 mRNA表达水平,采用western blot法检测各组肿瘤组织YAP1及下游靶基因(IGF、Akt、Jag-1、TGF-β)蛋白表达。收集本院泌尿外科2015年2月～2017年10月期间采用手术切除治疗的52例膀胱癌及癌旁组织标本,同时收集40例膀胱炎症组织标本。采用免疫组织化学方法检测膀胱癌组织、癌旁组织及膀胱炎症组织YAP1蛋白表达水平,比较YAP1在膀胱癌组织、膀胱癌癌旁组织及膀胱炎症组织中的表达水平,同时分析膀胱癌组织中YAP1表达水平与年龄、性别、组织学分级、肿瘤数目、肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期等临床病理特征的相关性关系。结果:1.qPCR检测T24细胞阳性表达YAP1基因,用Lipofectamine2000成功将不同YAP1shRNA质粒转染入T24细胞；qPCR检测发现YAP1shRNA3质粒沉默T24细胞YAP1表达效果最显著(抑制率75.5%),随后用YAP1 shRNA3质粒干扰T24细胞,MTT检测显示转染YAP1 shRNA3质粒组T24细胞增殖能力小于空白对照组(干扰组增殖率为空白对照组的85.9%,p0.01);转染YAP1shRNA3的T24细胞迁移能力较空白对照组低(24小时划痕宽度分别为220 μm和80μm,p0.01);转染YAP1shRNA3的T24细胞侵袭能力较空白对照组弱(穿透 Transwell 小室的平均细胞数 62:345,p0.01);2.YAP1 shRNA3-pGreenPuro组、Control-shRNA组及生理盐水组裸鼠治疗期间均存活,均有瘤体形成。各组裸鼠日常饮食未出现明显变化,精神状态较为良好,且体质量未出现明显减轻。各组裸鼠治疗后血常规、肝肾功能比较无显著性差异,且各组裸鼠心、肝、肾、脾等重要脏器均未出现明显异常表现;3.YAP1shRNA3-pGreenPuro组[(202.7±37.5)mm3]明显小于 Control-shRNA 组[(792.4±46.7)mm3]和生理盐水组[(798.6±50.2)mm3](P0.05)。YAP1 shRNA3-pGreenPuro组、Control-shRNA 组及生理盐水组的抑瘤率分别为74.2%、3.7%、3.6%;4.光学显微镜下观察可发现Control-shRNA组和生理盐水组肿瘤细胞生长良好,肿瘤细胞形态呈不规则表现,可发现存在有较多的肿瘤细胞核分裂象,而YAP1 shRNA3-pGreenPuro组肿瘤生长受到明显的抑制,肿瘤细胞核分裂象较Control-shRNA组和生理盐水组明显减少,且出现肿瘤坏死区,其中细胞结构消失,存在细胞崩解碎片等表现;5.YAP1 shRNA3-pGreenPuro 组 YAP1 mRNA 表达水平明显低于 Control-shRNA 组和生理盐水组(P0.05),而Control-shRNA组与生理盐水组比较无显著差异性(P0.05);6.YAP1 shRNA3-pGreenPuro组肿瘤组织YAP1及下游靶基因蛋白(IGF、Akt、Jag-1、TGF-β)表达水平均明显低于Control-shRNA组和生理盐水组(P0.05),而Control-shRNA组与生理盐水组比较无显著差异性(P0.05);7.膀胱癌组YAP1阳性表达率(80.77%,42/52)明显高于膀胱癌癌旁组(46.15%,24/52)和膀胱炎症组(20.0%,8/40)(P0.05),而膀胱癌癌旁组(46.15%,24/52)明显高于膀胱炎症组(20.0%,8/40)(P0.05);8.YAP1表达水平与膀胱癌患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤数目无明显相关性关系(P0.05),而与肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期有明显相关性关系(P0.05)。结论:YAP1 shRNA3-pGreenPuro能明显降低人膀胱癌T24细胞内的YAP1基因表达,并抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,通过降低肿瘤组织YAP1及下游靶基因蛋白(IGF、Akt、Jag-1、TGF-β)表达水平可明显抑制人膀胱癌裸鼠肿瘤组织生长,此外还证实膀胱癌患者YAP1表达水平与肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期有明显相关性关系(P0.05),可作为预测膀胱癌病情及治疗的新靶点。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.14
【部分图文】：

阳性克隆,测序,生物科技,鉴定图

注：１－３、５－８邋为邋ｓｈＲＮＡ－ｌ邋阳性克隆；９－１２、１４、１５邋为邋ｓｈＲＮＡ－２邋阳性克隆；１７、１８、２１－２３逡逑为ｓｈＲＮＡ－３阳性克隆；２５－３２为ｓｈＲＮＡ－ＮＣ阳性克隆逡逑图１．２邋ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ重组质粒阳性克隆鉴定图逡逑３．３测序证实逡逑将摇菌产物每组挑选３个克隆，送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，逡逑１３逡逑

序图,阳性克隆,质粒,细胞

３．４邋ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ质粒干扰效果检测逡逑将ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ重组质粒转染至Ｔ２４细胞，用实时定量反转录逡逑聚合酶链反应（ＲＴ－ｑＰＣＲ）鉴定干扰质粒对Ｔ２４细胞ＹＡＰ１基因的沉默效果，结果逡逑显示４种ＹＡＰｌｓｈＲＮＡ质粒均能有效沉默ＹＡＰ１基因的表达（抑制率分别为３７．４％，逡逑５１．８％，７５．５％和５０．５％），其中ＹＡＰ１邋ｓｈＲＮＡ３质粒沉默Ｔ２４细胞ＹＡＰ１表达效果逡逑最显著（尸＜０．０５），详见图１．４。逡逑

效果图,质粒,细胞,增殖率

４８小时后ＭＴＴ结果显示干扰组增殖率为空白对照组的８５．９％（Ｐ＜０．０５），逡逑提示ＹＡＰｌ邋ｓｈＲＮＡ３－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ重组质粒能抑制Ｔ２４细胞的增殖，有统计学意义，逡逑详见图１．５。逡逑＾１０＇逡逑°－９＇逦上逡逑Ｍｇ逡逑思。逡逑Ａ，逡逑图１．５邋ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ干扰质粒对Ｔ２４细胞增殖能力的影响逡逑（注：与空白组比较，＊Ｐ＜０．０５）逡逑１５逡逑

【参考文献】