iEESI-MS快速鉴别胸部恶性肿瘤组织的实验研究

发布时间：2020-09-03 18:50

　　 非小细胞肺癌和食管癌是我国最常见胸部恶性肿瘤,其发病率呈上升趋势,而胸部肿瘤死亡病例约占了恶性肿瘤相关死亡病例的1/3。本研究拟探讨iEESI-MS在快速区分胸部常见恶性肿瘤的癌组织及配对癌旁正常组织的应用价值,并探索其差异性离子在肿瘤发生发展中的生物学意义。1.内部萃取电喷雾电离质谱技术在快速区分NSCLC组织中的实验研究目的:探讨内部萃取电喷雾电离质谱技术(iEESI-MS)在快速区分配对肺癌组织及癌旁正常肺组织中的应用价值,研究磷脂类物质差异性表达在肺癌发生发展中的生物学意义。方法:采用自主设计的自制精密取样器及自主开发的iEESI-MS在无需预处理的情况下对我院纳入研究的51例配对肺癌组织和癌旁正常肺组织进行分析;设置iEESI-MS离子源为正离子模式,质谱扫描范围设置为m/z 50-2000 Da;电离电压为+4.5 k V;离子传输管温度设置为150℃;离子传输管电压设置为35 V;透镜电压设置为100 V;其它质谱参数均由LTQ-MS系统自动优化;萃取剂为水/甲醇/乙酸(35:65:0.01,v/v/v),流速为0.5μL/min。在Matlab软件对获得样本iEESI-MS质谱指纹图谱数据进行PLS计算分析得到区分结果。差异性离子相对丰度用SPSS 21.0进行比较。结果:本方法能在1min内完成取样、质谱指纹数据获得及分析;肺癌组织一级质谱指纹谱图主要离子为m/z 154.00,m/z 188.14,m/z 301.19,m/z 317.14,m/z 772.65,m/z 782.72,m/z 798.67,m/z 824.70,m/z 848.70;而癌旁正常肺组织一级质谱指纹谱图主要离子为m/z 158.16,m/z 227.26,m/z 274.41,m/z 318.45,m/z 518.56,m/z 728.76,m/z 756.80,m/z 782.76,m/z 804.72,m/z 832.76。经过PLS分析,两组样本的质谱指纹图谱数据能够明显区分,且发现对于区分两组样本的主要差异性离子为m/z 706,m/z 757,m/z 773,m/z 783,m/z 799。比较发现肺癌组织中m/z 706,m/z 773,m/z 783,m/z 799明显高于正常组织,而正常组织中m/z 757的相对丰度明显高于癌组织(P0.05)。运用CID实验,差异性离子m/z 757,m/z 773,m/z 783,m/z 799被鉴别为二棕榈磷脂酰胆碱+钠离子(DPPC+Na+),二棕榈磷脂酰胆碱+钾离子(DPPC+K+),鞘磷脂+氢离子(SM+H+),磷脂酰甘油+氢离子(PG+H+)。结论:内部萃取电喷雾电离质谱技术(iEESI-MS)耦合PLS能够快速区分肺癌组织及癌旁正常肺组织,有望成为术中快速区分肺癌组织的新方法,并为探索NSCLC的磷脂类物质代谢组学提供新方向。2.内部萃取电喷雾电离质谱法在快速区分食管癌组织中的实验研究目的:探讨内部萃取电喷雾电离质谱技术(iEESI-MS)在快速区分配对食管癌组织及癌旁正常食管组织中的应用价值,探讨氨基酸类物质差异性表达的食管癌发生发展中的生物学意义。方法:采用自主设计的自制精密取样器及自主开发的iEESI-MS在无预处理的情况下对我院纳入研究的32例配对食管癌组织及正常食管样本进行分析;设置iEESI-MS离子源为正离子模式,质谱扫描范围m/z 50-300 Da;电离电压为+4.5k V;离子传输管温度为150℃;离子传输管电压为35 V;透镜电压为100 V;其它质谱参数均由LTQ-MS系统自动优化;萃取剂为水:甲醇:乙酸溶液(50:50:0.01,v/v/v),流速为0.5μL/min。用Matlab软件对获得样本iEESI-MS质谱指纹图谱数据进行PLS计算分析得到区分结果,用SPSS 21.0对差异性离子相对丰度进行比较及评估其对区分的有效性。结果:本方法能在1min内完成取样、质谱指纹数据获得及分析;食管癌组织一级质谱指纹图谱主要离子为m/z 56.97、m/z 104.13、m/z 116.10、m/z 132.13、m/z147.16、m/z 154.06、m/z 156.08、m/z 175.13等,而正常食管组织主要以m/z 58.96、m/z 74.03、m/z 82.99、m/z 133.11、m/z 138.03、m/z147.09、m/z 154.06、m/z 175.12、m/z 188.05等离子为主。经过PLS分析,两组样本的质谱指纹图谱数据能够明显区分,比较发现在食管癌组织中m/z 104.13、m/z 116.10、m/z 132.13和m/z175.13明显高于正常组织,而正常食管组织中m/z 82.99、m/z 133.11、m/z147.08、m/z154.06和m/z 188.05的相对丰度明显高于癌组织(P0.05);运用CID实验,鉴别差异性离子m/z104.13为二甲基甘氨酸,m/z116.10为脯氨酸,m/z132.13为异亮氨酸,m/z133.11为天冬酰胺,m/z147.08为谷氨酰胺,而m/z175.13为精氨酸。运用ROC曲线对差异性物质进行区分有效性的评估,发现二甲基甘氨酸(DMG)、脯氨酸、异亮氨酸、精氨酸对于区分两组样本的有效性优于天冬酰胺和谷氨酰胺。结论:内部萃取电喷雾电离质谱法(iEESI-MS)耦合PLS分析能够基于氨基酸类物质差异表达快速区分食管癌及癌旁正常组织,为术中快速区分食管癌组织提供了新方法,为食管癌氨基酸代谢的研究提供了新方向。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.1;R734.2
【部分图文】：

实验步骤验参数优化建 iEESI-MS 离子源装置，用自制精密取样器取样并优化各实验参数，构见图 1。优化参数时利用控制变量法，只调节 1 个参数，且同一个参过程用同一样本（正常肺组织）并在同一次实验内完成。建好 iEESI-MS 离子源后，不放置组织样品，将取样器样本出口离质谱离调节为 5 mm，固定实验装置，避免距离变动；根据前期实验组织喷谱实验结果，选择初始萃取剂为纯甲醇，流速 0.4ul/min；设置离子扫正离子模式，离子扫描质量范围 50～2000 Da；离子传输管温度设置，离子传输管电压设置为 35 V，透镜电压设置为 100 V，其他条件 LTQ-动优化。首先，进样萃取剂用于检测质谱仪的清洁状况及运行状态，开检查是否有信号干扰，如有杂质信号干扰，则清洗离子源及质谱仪口，步骤至无干扰信号。

第二章 内部萃取电喷雾电离质谱分析技术参数优化及实验步骤用自制精密取样器切取样本并上样，调节不同离子模式（正离子模式子模式，每种离子模式最少持续扫描 2 分钟以上），经过重复试验，得到组织样品在不同离子模式下的典型质谱指纹图谱（图 2），可见正离子模得到更为丰富的组织样品质谱指纹，故离子扫描方式确定为正离子模式。

图 3 信号强度与电喷雾电压的关系注：图中数据均只取离子强度等级2.1.3 取样器样本出口与质谱入口的距离的确定如图 4 所示，根据 iEESI-MS 的原理，样本形成的电喷雾进入质谱仪才能检测到信号，且存在样本出口与质谱口的最佳距离能够得到稳定的谱图，在前期研究的基础上，此距离的优化范围我们设定为 3～12mm；在其他参数不变的的条件才下，从 3mm 调节至 12mm，每次距离递增 1mm，每一距离持续扫描 2 分钟，根据实验结果，我们发现随着取样器样本出口与质谱入口的距离增大，质谱信号强度先增强而减弱，3～5mm 变化时逐渐增强，当距离为 5mm 时所捕获的质谱指纹谱图信号强且稳定，5～12mm 变化时质谱指纹谱图信号强度由于距离的增加出现减弱趋势。故本研究将样本与质谱口距离设定为 5mm。

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本文编号：2811827