前言:胃癌是世界上第二大因癌症而造成的死亡原因,也是东北亚地区发病率最高的恶性肿瘤之一。尽管采用多种方法来提高胃癌患者的生存率,但晚期胃癌患者的生存时间仍然很短,有效的治疗方法有限。因此,确定新的早期诊断生物标志物和开展新的抗癌靶向治疗势在必行。研究发现,非编码RNA,尤其是microRNA(miRNA,miR),在肿瘤进展过程中发挥了重要的调控作用。miRNA是一类内源性的、非编码单链小RNA,大概19-25个核苷酸长度。miRNA可以识别特定的靶基因,并能够特异性的与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)结合,在转录后水平直接促进靶基因mRNA的降解和/或抑制靶蛋白的翻译,在肿瘤细胞中起抑癌基因或促癌基因的作用,参与到细胞的分化、增殖、凋亡和转移等多种生物学过程中。研究结果表明,许多的miRNA,如miR-122,miR-26a、和miR-200c等,在胃癌中表达出现失调,这表明miRNA可能作为胃癌诊断及预后判断的一类新的标志物。mir-1236-3p,是一种内含子miRNA,位于染色体6p21.33上,包含在NELFE基因的内含子中。越来越多的证据表明,miR-1236-3p在肿瘤中可能起到了抑制基因的作用,在多种肿瘤中已出现miR-1236-3p表达下调。例如,在原发性肝细胞癌中,miR-1236-3p下调甲胎蛋白(AFP),从而导致PTEN的积累,信号通路PI3K/Akt受到抑制。在高分化浆液性卵巢癌中,miR-1236-3p通过作用于靶基因ZEB1来使细胞的迁移和侵袭能力受到抑制。此外,miR-1236-3p表达下调在膀胱癌、肺癌和乳腺癌中也有报道,然而,它在胃癌中的生物学功能到目前为止仍不清楚。通过初步检测,我们发现miR-1236-3p在胃癌呈现显著下调,可能作为胃癌的诊断以及治疗的一个潜在标志物和靶点。目的:本研究的目的是探讨miR-1236-3p在人类胃癌组织及胃癌细胞系中的表达情况,以及与胃癌的发生发展及临床病理学特征的关系,进行miR-1236-3p功能学实验以探究其生物学作用,鉴定其调控的靶基因,并检测miR-1236-3p上调或下调后对细胞上皮-间质转化(EMT)和PI3K/Akt信号通路的影响。为研究胃癌发展机制以及胃癌的基因治疗和靶向治疗提供新的途径和靶点。方法:1.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-1236-3p在83例胃癌组织和配对癌旁组织中的表达,分析两者表达水平上的差异以及与临床病理学特征的关系;同时,使用qRT-PCR检测miR-1236-3p在人正常胃粘膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株MKN-45、SGC-7901及MGC-803中的表达情况。2.运用慢病毒颗粒对SGC-7901细胞中的miR-1236-3p进行过表达,在MKN-45细胞中抑制miR-1236-3p的表达。体外实验部分,CCK-8法检测miR-1236-3p对胃癌细胞增殖能力产生的影响;划痕愈合实验和transwell迁移实验用来检测miR-1236-3p对胃癌细胞迁移能力的作用;transwell侵袭实验验证miR-1236-3p是否对胃癌细胞的侵袭能力造成影响。体内实验部分,通过裸鼠皮下移植瘤模型,分析验证miR-1236-3p对裸鼠体内移植瘤的生长能力的作用。3.使用在线靶基因预测软件预测miR-1236-3p的与转移相关的靶基因,并通过双荧光素酶检测技术对miR-1236-3p与其靶基因的结合位点进行进一步明确;qRT-PCR和Western blot检测过表达miR-1236-3p或抑制miR-1236-3p的表达对靶基因的影响。4.观察miR-1236-3p过表达组和抑制组细胞的形态变化情况。Western blot分别检测miR-1236-3p过表达组、抑制组、各阴性对照组和空白对照组细胞内E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白的表达变化。5.Western blot检测miR-1236-3p过表达组、抑制组以及阴性对照组细胞内p-AKT(Ser473)和AKT在蛋白水平的表达变化。结果:1.qRT-PCR结果显示miR-1236-3p在83例胃癌组织中表达水平明显低于配对的癌旁组织(P0.001)。在胃癌中miR-1236-3p的表达水平与病变的TNM分期、分化程度和淋巴结转移关系密切,胃癌中的miR-1236-3p表达越低,TNM分期就越晚(P=0.003),分化程度也越差(P=0.015);而miR-1236-3p表达越高,淋巴结转移率就会越低(P=0.018)。2.把人胃正常粘膜上皮细胞GES-1作为对照组,miR-1236-3p在胃癌细胞系SGC-7901、MKN-45和MGC-803中的表达水平显著低于人胃正常粘膜上皮细胞株(P0.05)。其中,miR-1236-3p在SGC-7901细胞中的表达相对最低,在MKN-45细胞中表达相对最高,因此,过表达SGC-7901细胞中miR-1236-3p的水平,抑制MKN-45细胞中miR-1236-3p的表达水平。3.CCK-8测胃癌细胞OD值,结果显示:过表达miR-1236-3p可明显抑制胃癌细胞的增殖(P0.01),抑制miR-1236-3p的表达能显著促进胃癌细胞的增殖(P0.01)。4.划痕愈合实验显示miR-1236-3p能减慢伤口愈合,降低胃癌细胞的迁移能力,SGC-7901细胞miR-1236-3p过表达组48h后划痕仍有较宽的距离,而两组对照组划痕有明显的变窄。抑制miR-1236-3p表达的MKN-45细胞48h后划痕明显比对照组窄。Transwell迁移实验的结果中,与对照组相比,SGC-7901细胞miR-1236-3p过表达组48h后Transwell小室每个视野中的细胞数明显减少,P0.01;而MKN-45细胞miR-1236-3p抑制组48h后细胞数明显增多,P0.05。两实验均提示miR-1236-3p对胃癌细胞迁移能力具有抑制作用。5.Transwell侵袭实验证实,miR-1236-3p能够显著降低胃癌细胞的侵袭能力。与对照组相比,SGC-7901细胞miR-1236-3p过表达组48h后Transwell小室中每视野内的细胞数明显减少,P0.001;而MKN-45细胞miR-1236-3p抑制组48h后每视野内的细胞数明显增多,P0.01。6.裸鼠成瘤模型结果显示,miR-1236-3p过表达组肿瘤体积明显减小(P0.01),肿瘤重量明显减轻(P0.01)。7.通过靶基因在线预测软件Targetscan,miRDB和miRanda,我们推测MTA2可能是miR-1236-3p的靶基因。qRT-PCR和Western blot检测miR-1236-3p过表达组和抑制组MTA2表达结果,证实MTA2在mRNA水平和蛋白水平的表达都有所变化,miR-1236-3p是通过转录后水平抑制靶基因MTA2的表达。再结合双荧光素酶实验结果,进一步验证了MTA2是miR-1236-3p肿瘤转移相关靶基因。8.通过Western blot实验检测miR-1236-3p过表达组、抑制组及各对照组细胞内E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白表达结果,我们发现当miR-1236-3p过度表达时,E-钙粘蛋白表达升高(P0.001),但是N-钙粘蛋白表达降低(P0.001);miR-1236-3p抑制后,E-钙粘蛋白表达降低(P0.05),但是N-钙粘蛋白表达增加(P0.001)。同时,观察miR-1236-3p过表达组和抑制组细胞的形态变化发现,与正常对照组细胞相比,miR-1236-3p过表达组的SGC-7901细胞形态,从一个扩展延伸的形态向更有组织的细胞与细胞间紧密接触的形态转变,而在miR-1236-3p抑制组MKN-45细胞中则有相反的结果。9.Western blot实验检测miR-1236-3p过表达组、抑制组及各对照组细胞内pAKT(Ser473)和AKT在蛋白水平的表达变化结果显示,miR-1236-3p过表达组的p-AKT蛋白表达水平明显低于对照组,P0.001;而在miR-1236-3p抑制组的pAKT蛋白表达水平明显高于对照组,P0.001。各组的AKT蛋白的表达水平无明显不同。结论:1.miR-1236-3p在胃癌细胞株和胃癌组织中的表达均呈现明显降低,miR-1236-3p的低表达与胃癌患者的TNM分期,分化程度以及淋巴结转移都存在密切联系。2.miR-1236-3p在胃癌中表现为抑癌基因的作用,对胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移产生抑制作用。3.miR-1236-3p直接下调靶基因MTA2的表达来抑制胃癌侵袭转移,通过对靶基因调控抑制胃癌发展。4.miR-1236-3p直接抑制了胃癌细胞上皮-间质转化(EMT)过程,并且对PI3K/Akt信号通路也产生抑制作用。miR-1236-3p/MTA2调控机制为胃癌转移的研究提供了一个新机制,并为胃癌治疗提供了一个潜在新靶点。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：
中国医科大学博士学位论文差（P=0.015），差异具有统计学意义；miR-1236-3p 表达越高转移的几率越低，P=0.018，差异同样具有明显统计学意义。而水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小等其他临床病理学特征无
miR-1236-3p在胃癌细胞系和正常胃粘膜上皮细胞中的相对表达数据以均数±标准差表示，*表示P＜0.05
胃癌细胞SGC-7901转染mimic后的转染效率评价
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