基于适体触发原位滚环扩增的体液稀有肿瘤细胞检测新方法

发布时间：2020-09-10 21:30

　　体液标本中播散肿瘤细胞的检测作为一种相对无创的液体活检方式已广泛用于肿瘤的早期诊断、治疗指导、复发与转移评估,对肿瘤的个体化治疗及预后评估等具有重要临床意义。尤其是对于一些难以耐受活检等侵入式检查和难以获得肿瘤组织标本的患者,该检查显得尤为重要。目前,播散肿瘤细胞检测面临最大的挑战是其在外周血和体液中的含量非常低,现有方法无法实现灵敏检测。因此,本课题设计了基于适体识别靶细胞并触发细胞表面原位滚环扩增的新方法用于体液中稀有肿瘤细胞的高灵敏检测。本课题以乳腺癌细胞MCF-7为模式检测对象,设计一条上皮细胞黏附分子(EpCAM)适体-引物复合探针,其中适体部分作为识别元件特异地识别结合EpCAM阳性肿瘤细胞,随后引物部分可触发细胞表面原位滚环扩增,产生大量富含鸟嘌呤的G四联体序列。G-四联体/hemin DNA酶折叠形成后可以催化比色反应实现肿瘤细胞的检测。在混有不同浓度靶细胞的悬液(细胞总数为105个)中,本方法得到的最低检测限为10个肿瘤细胞,即低至0.01%的靶细胞仍可被检出。针对10例临床体液标本检测(包括5例良性体液标本和5例不同来源的恶性体液标本),该方法展示了良好的特异性和临床适用性。本文建立的基于适体识别靶细胞触发表面滚环扩增的肿瘤细胞检测新方法具有简单快速、灵敏度高、特异性好的优点;并成功用于临床体液标本中稀有肿瘤细胞的检测。该方法为外周血或体液中稀有肿瘤细胞的检测提供了新的技术支持,具有广阔的临床应用前景。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.43
【部分图文】：

序列,锁式探针,条带,引物

为了进一步验证ＲＣＡ产物与Ｈｅｍｉｎ结合后可以催化ＡＢＴＳ－Ｈ２０２系统，我们逡逑通过紫外分光度计测量４００邋ｒｎｎ到５００邋ｎｍ波长的吸光度变化，取４１８邋ｎｍ处的吸光逡逑度测量值为结果，可看到有一个明显的特征峰（图２Ｂ），说明基于适体触发ＲＣＡ逡逑产物中的Ｇ－四联体序列与Ｈｅｍｉｎ结合后形成了邋Ｇ－四联体／ｈｅｍｉｎ邋ＤＮＡ酶，催化底逡逑物发生比色反应使吸光度产生变化。与此同时，我们也测量了空白与没有加入ＡＰＰ逡逑只有纯化环状模板参与的ＲＣＡ产物的吸光度值，结果显示波长４１８邋ｎｍ处几乎没逡逑有明显的特征峰，进一步的证明了环状模板已经成功被纯化，在没有引物存在的逡逑情况下自身不会发生ＲＣＡ反应无背景信号产生，而且结果同时还证明了游离的逡逑Ｈｅｍｉｎ不会催化ＡＢＴＳ－Ｈ２０２系统产生背景信号。所以，在后续的细胞实验中离心逡逑后不需要去除游离的Ｈｅｍｉｎ。逡逑Ｍｌ邋２逦３逦４逦５逦＾逡逑Ａ逦Ｂ逡逑，Ａ逡逑ｍ邋４２ａ逦４４？逦ｍ逡逑）．（ｎｍ）逡逑图２邋（Ａ）聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图：（条带１）引物探针

实验条件优化,吸光度,细胞,反应时间

为了实现最优的检测性能，我们对几个实验条件进行了优化。首先，多功能逡逑的ＡＰＰ含有触发ＲＣＡ的引物部分，对结果有重要的影响意义。因此，ＡＰＰ与细逡逑胞悬液的反应时间首先被优化［１７］。如图４Ａ所示，吸光度信号随着ＡＰＰ反应的时逡逑间增加而上升，在反应４０分钟时达到最大值，所以４０分钟被选为最佳的反应时逡逑间。另外，ＲＣＡ的时间也是一个重要参数［３６］。依据图４Ｂ所示，吸光度信号随着逡逑ＲＣＡ反应时间增加而上升，在反应４０分钟后达到最大值。但继续延长反应时间并逡逑没有使信号增加反而使信号降低，这可能是因为延长反应时间使ＲＣＡ产物分子量逡逑太大而从细胞表面脱离。因此，我们选择４０分钟作为最佳反应时间。为了提高检逡逑测效率，我们同样分析了邋Ｈｅｍｉｎ浓度的影响，发现在１．４邋ｍＭ时达到最大值。逡逑Ａ逦Ｂ邋｜邋０］逦Ｃ邋ｕ逡逑！：：！：：邋Ｊ｜｜！ｉ逡逑１０逦２０邋ｍ邋４０逦？逦１０逦２０逦３？逦４４１逦５０逦Ｕ邋＊？＊逦１（４逡逑Ｉｎｃｕｂｔｔｉｏｎ邋Ｔｉｍ？邋（ｎｔｉｎ）逦ＲＣＡ邋Ｔｉｍｅ邋（ｍ邋Ｉｎ）逦Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｅｒｎｉａ邋（ｐＭ）逡逑图４实验条件优化：所有的吸光度均在１０５个ＭＣＦ－７细胞下测定。（Ａ）邋ＡＰＰ反应时间，（Ｂ）逡逑ＲＣＡ反应时间

比色分析,误差棒,校准曲线,白细胞

为了模拟真实的恶性体液样本，我们把不同数量的ＭＣＦ－７细胞混入正常的白逡逑细胞中保证细胞总数为１0５个［３７］。在上述最优的实验条件下，吸光度随着ＭＣＦ－７逡逑靶细胞数量的增加而增加（图５Ａ）。ＭＣＦ－７靶细胞数量的对数从１０到３００００个细逡逑胞之间与其吸光度信号与有着较好的线性关系，相关系数为０．９９７邋（图５Ｂ）。最低逡逑检测线可达１０个靶细胞／ｍＬ，相当于在总数为１０５个细胞混合液中可检测到０．０１％逡逑ＭＣＦ－７细胞，展示了本策略良好的检测低丰度肿瘤细胞的分析性能。相比于之前逡逑报道的比色分析和基于适体标记纳米粒子［２３，２４］和适体修饰传感器表面［３７，２２，３８］检测逡逑肿瘤细胞的方法，本方案有着更优或相当的灵敏度（表２）。这是因为本方法结合逡逑了邋ＥｐＣＡＭ适体的高特异性和细胞表面ＲＣＡ反应的氋效信号扩增能力以及Ｇ－四联逡逑体／ｈｅｍｉｎＤＮＡ酶的高催化能力。与之前报道过检测肿瘤细胞生物传感方法最不同逡逑的一点是，本方法良好的分析性能是通过模拟真实临床标本将低丰度肿瘤细胞混逡逑入大量的正常白细胞中得到的，而不是简单的检测纯的肿瘤细胞。逡逑（ｊ邋Ｂ逡逑ｉ．ａ－逦｜逡逑Ｉ逦＼逦Ｓ邋ｔ逡逑＾〔二逦逦：邋0＿丨＿邋■逡逑￣＾￣ｍ￣Ｚ￣Ｚ￣逦＂邋？逦Ｚ１邋￣＾￣＾￣ｒａｉ７逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋＞１ＣＦ－７逡逑图５邋（Ａ）紫外吸收光谱图

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