袢状核酸内切酶FEN1参与乳腺癌细胞侵袭转移及他莫昔芬耐药的机制研究

发布时间：2020-09-10 21:32

　　目的:乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的健康。ASCO最新数据报告,2016年美国有240,000的女性被诊断乳腺癌,有40,000患者因乳腺癌死亡。中国癌症流行病学调查数据显示,2015年我国被诊断乳腺癌的患者人数为272,400人,死亡人数为70,700人。尽管手术、化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗的应用提高了乳腺癌患者的无疾病生存率和总生存率,但是还有很大比例的患者面临肿瘤的复发和转移以及耐药的风险。因此,深入探讨乳腺癌的复发、转移的分子机制,探索乳腺癌的耐药原因,寻找能够预测疾病复发、转移及耐药的生物标志物,对改善乳腺癌的疾病转归及抵抗有效药物的耐药至关重要。袢状核酸内切酶1(Flap endonuclease-1,FEN1)作为一种结构特异性的核酸酶,具有5'-flap核酸内切酶(FEN)、缺口依赖性核酸内切酶(GEN)和5'核酸外切酶(EXO)的活性,在冈崎片段的成熟、碱基切除修复、端粒稳定性的维持、凋亡诱导的DNA降解、三核苷酸重复序列以及停止复制叉的重启等多个DNA复制和修复过程中扮演重要角色。有报道证实FEN1多态性改变和基因突变,能够使其DNA复制和修复等生物学功能出现缺陷或者丧失,从而引发基因组不稳定和癌症的发生。此外,很多研究发现FEN1的高表达与肿瘤的发生、发展密切相关。既往研究发现FEN1在多种肿瘤组织其表达显著高于癌旁组织,过表达FEN1能够使正常乳腺上皮向肿瘤表型转化,并且FEN1的高表达能够增强乳腺癌细胞和胃癌细胞增殖,与乳腺癌的组织学分级和前列腺癌Gleason评分增高一致,说明FEN1高表达在肿瘤恶变和增殖中发挥重要作用。还有一些单中心的回顾性研究发现FEN1高表达与乳腺癌、卵巢癌、胃癌的T分期、区域淋巴结转移、分化差等不良预后因素相关,并且与无疾病生存期和总生存缩短相关,说明FEN1高表达在肿瘤转移、预后中同样具有至关重要的作用。但是,目前FEN1在肿瘤细胞侵袭转移过程中发挥的作用和机制尚不明确,FEN1对肿瘤的预后意义也没有大样本、多中心的研究证实,所以深入研究FEN1对肿瘤侵袭转移的影响和其疾病预后价值,对于了解肿瘤的转移机制和寻找有效的肿瘤标志物具有重要意义。耐药是肿瘤治疗过程中常见而棘手的问题,而内分泌治疗的耐药是激素受体阳性乳腺癌患者预后差的一个重要因素。既往有研究发现FEN1表达水平的增高在雌激素相关的乳腺癌和子宫癌最明显,并且FEN1能够直接与ERα相互作用,增强ERα与ERE的DNA转录功能,同时雌激素能够对FEN1表达进行调控,说明FEN1与雌激素、ERα和ERE之间存在潜在的相互作用。此外还有研究初步发现FEN1的高表达与替莫唑胺、顺铂、紫杉醇、氟尿嘧啶等抗肿瘤药物的耐药相关,抑制FEN1的表达可以增加抗肿瘤药物的敏感性,但是这些研究都局限于MTT、细胞周期分析等现象层面,没有对FEN1导致的耐药进行深入的机制探讨和说明,并且FEN1对于他莫昔芬敏感性的影响也无相关报道。所以,了解FEN1对他莫昔芬疗效的影响,为逆转乳腺癌内分泌耐药提供新的思路和研究基础。本研究首先利用在线数据库oncomine数据平台和Kaplan Meimer plotter生存分析公共数据库更加全面、客观地评价FEN1 mRNA表达与乳腺癌患者的临床病理学参数、临床结局、分子分型和生存中的相关性和价值,并用本中心乳腺癌组织芯片验证。通过细胞实验证实FEN1参与三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移和ER阳性乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药,并且对FEN1促转移和介导他莫昔芬耐药的分子机制进行了深入的探究,并且通过生存分析发现FEN1高表达是乳腺癌患者不良预后的生物标志物。上述研究结果为进一步认识FEN1新的生物学作用提供理论基础。材料与方法:1.采用倒置荧光显微镜观察细胞形态及慢病毒转染效率2.构建沉默FEN1的化学合成siRNA和过表达FEN1基因的真核质粒表达载体。3.构建靶向沉默和过表达FEN1基因的慢病毒表达载体,建立稳定转染的乳腺癌细胞系HCC1937、MDA-MB-231、MCF-7和T47D。4.采用Transwell法测定细胞迁移能力。5.采用MTT法测定细胞活力。6.采用集落形成实验观察处理前后细胞克隆的形成。7.动物实验建立乳腺癌肺转移模型,研究敲除及过表达FEN1表达对乳腺癌细胞肺转移病灶数的影响。8.HE及免疫组化染色检测裸鼠肺组织标本中乳腺癌细胞的转移及FEN1表达。9.采用Western blot检测FEN1,PTEN,p-AKT,AKT,p-ERK,ERK和GAPDH蛋白的表达。10.采用Real-time PCR技术检测PTEN的mRNA表达水平及microRNA-26b-5p的表达水平。11.采用Gene Chip m RNA和miRNA Array检测敲减FEN1前后乳腺癌细胞系中mRNA和microRNA表达谱。12.采用Lipofectamine2000试剂瞬时转染FEN1的siRNA和过表达质粒,以及转染microRNA-26b-5p-mimic和microRNA-26b-5p-inhibitor。13.免疫组化检测乳腺癌组织芯片中FEN1、pAKT、pERK的表达。14.GEO数据集采用下载并进行差异性表达分析。15.所有数据采用3次独立实验结果,以均值±标准差(±s)进行表示。采用SPSS 18.0统计分析软件进行统计学分析。组间比较采用t检验,P0.05有统计学意义。结果:1、FEN1高表达与乳腺癌患者的复发、转移和三阴分子分型相关。Oncomine数据库分析结果发现FEN1 mRNA在乳腺癌组织表达高于乳腺正常组织,FEN1 mRNA表达与乳腺癌临床病理学参数的关系结果显示,FEN1表达水平与组织学分级正相关,随着分级的增加而增高,在发生淋巴结转移(N+)和远处转移(M+)的乳腺癌患者中高表达;FEN1表达与乳腺癌患者临床结果的关系结果显示,FEN1在发生3、5年肿瘤复发患者中mRNA表达高于无复发的患者,在术后1、3、5年出现转移的乳腺癌患者中FEN1 mRNA表达高于未发生转移的患者,在术后1年出现死亡的乳腺癌患者中FEN1 mRNA表达高于未死亡的患者;通过多个数据集的meta分析,结果显示FEN1 mRNA在三阴性乳腺癌中的表达高于非三阴乳腺癌患者。上述结果提示,FEN1高表达与乳腺癌患者的不良预后的临床病理学参数、复发转移和三阴性乳腺癌的分子分型密切相关。2、FEN1 mRNA高表达与乳腺癌患者的不良预后相关。在线数据库Kaplan Meier plotte分析结果显示FEN1高表达乳腺癌患者的RFS、DMFS和OS显著缩短,FEN1高表达对ER阳性乳腺癌患者和ER阳性接受他莫昔芬辅助内分泌治疗的乳腺癌患者的RFS、DMFS和OS的影响更为明显,在三阴性乳腺癌患者生存分析未见阳性结果。以上结果说明,FEN1 mRNA高表达与乳腺癌患者,尤其是ER阳性和接受他莫昔芬辅助内分泌治疗的ER阳性乳腺癌患者的不良预后相关。3、FEN1蛋白高表达与三阴性乳腺癌患者淋巴结转移和远处转移相关。对本中心乳腺癌组织芯片进行FEN1蛋白免疫组化染色,结果发现FEN1蛋白在三阴乳腺癌分子分型的表达高于非三阴的患者。三阴性乳腺癌亚组分析中,FEN1的高表达与淋巴结转移、更短的无远处转移生存期和总生存期显著相关。以上结果提示,FEN1高表达是三阴性乳腺癌发生疾病复发和死亡的生物标志物。4、FEN1促进三阴性乳腺癌细胞的迁移和转移。应用慢病毒表达载体建立沉默和过表达FEN1基因的稳转三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC1937,Transwell实验证实沉默FEN1降低细胞的迁移能力,MDA-MB-231细胞平均迁移率降至59.4±5.11%(p0.05),HCC1937细胞平均迁移率降至44.33±9.97%(p0.05);过表达FEN1增强细胞迁移能力,MDA-MB-231细胞平均迁移率上升至127.1±11.41%(p0.05),HCC1937细胞平均迁移率上升至206.31±16.27%(p0.05)。动物实验建立乳腺癌肺转移模型,将沉默和过表达FEN1基因及相应对照组MDA-MB-231细胞经裸鼠尾静脉注射,8周后,分别计数四组实验动物的肺转移病灶数,结果显示NC-KD FEN1组肺转移病灶数计算平均值为18.8±4.87,KD-FEN1组为5.6±2.3,(P0.05);计数NC-OE FEN1组肺转移病灶数计算平均值为29.8±2.68,OE-FEN1组为67.8±13.16,(P0.05)。体外实验和体内实验结果均提示沉默FEN1降低三阴性乳腺癌细胞迁移及转移,过表达FEN1促进三阴性乳腺癌细胞迁移及转移。5、FEN1依赖于PTEN/PI3K/AKT通路促进三阴性乳腺癌细胞的迁移。为了研究FEN1促进三阴性乳腺癌侵袭转移的分子机制,我们对敲减FEN1前后的乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行mRNA表达谱芯片,GO分析和Pathway分析提示MAPK通路和PI3K通路变化最为明显。对77例三阴性乳腺癌患者组织芯片进行FEN1、pAKT、pERK免疫组织化学染色进行相关性分析,发现FEN1与pAKT正相关(r=0.42,p=0.002),与pERK无显著相关性(r=0.12,p=0.72)。通过Western blot方法检测沉默和过表达FEN1基因的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中pERK和pAKT的变化情况,结果提示沉默FEN1后p AKT减少,过表达FEN1后的p AKT增多;而沉默或是过表达FEN1后,pERK无变化,我们推测FEN1可能是通过PI3K/AKT信号通路来影响三阴性乳腺癌的侵袭转移。为了验证以上推论,我们在过表达FEN1的细胞系中给予Akt抑制剂LY294002(20ng/ul),结果发现抑制p AKT能够抵消过表达FEN1后细胞迁移能力的增加,说明FEN1依赖PI3K/AKT通路促进三阴性乳腺癌细胞的迁移。进一步对PI3K/AKT通路的抑制分子PTEN的表达进行检测,结果显示FEN1能够负调控PTEN蛋白的表达,Realtime PCR检测沉默和过表达FEN1后,PTEN的mRNA水平无变化。以上结果提示,FEN1抑制PTEN的表达,活化AKT通路促进三阴性乳腺癌细胞迁移,而FEN1对PTEN表达的影响可能来自于转录后水平。6、FEN1通过miR-26b-5p/PTEN/AKT促进三阴性乳腺癌细胞的迁移。miRNAs是基因转录后修饰的重要途径,我们推测FEN1可能是通过调控miRNA的表达实现抑制PTEN的表达。通过敲除FEN1前后的MDA-MB-231进行miRNAs芯片分析和生物信息学预测靶向PTEN的miRNAs,并且用Realtime PCR和Western blot方法验证FEN1是通过miR-26b-5p调控PTEN促进三阴性乳腺癌迁移。以上结果提示miR-26b-5p在FEN1介导的三阴性乳腺癌细胞迁移过程中起到关键的作用,FEN1通过miR-26b-5p负调控PTEN介导三阴性乳腺癌细胞的迁移。7、FEN1参与他莫昔芬耐药。下载GEO数据库中有关他莫昔芬耐药的乳腺癌数据库,发现FEN1mRNA表达在他莫昔芬耐药细胞中高于他莫昔芬敏感细胞,提示FEN1对他莫昔芬耐药的过程中可能发挥作用。我们进一步用细胞实验证明MCF7和T47D过表达FEN1后,乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性降低;敲除FEN1后,他莫昔芬敏感性增加。以上结果提示FEN1参与了ER阳性乳腺癌患者他莫昔芬的耐药。结论:1.FEN1的高表达与乳腺癌复发/转移和三阴性分子分型相关。2.FEN1促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移。3.FEN1通过mi R26b-5p/PTEN/AKT促进三阴性乳腺癌细胞发生转移。4.FEN1在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系中高表达,与他莫昔芬耐药相关。5.FEN1高表达是他莫昔芬的疗效预测指标。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

乳腺癌,数据库,检索参数,肿瘤

中国医科大学博士学位论文括分泌的、激酶、膜和已知基因-药物靶点，这些对促进新的生物标志物和治疗靶点的发现，对侵袭性乳腺癌，特别是转移。运用 oncomine 数据库平台（https://www.oncomine.com/resource/login.html ）查找乳腺癌相关数据库，分析 FEN1在乳腺癌组织中 mRNA 水平表达，筛选的限定条件为"Analysis Type: Cancer vs.Normal Analysis"，检索参数为 p < 0.01，fold change>2，gene rank 为 top 5%; "CancerType: Breast Cancer; Clinical Outcome: Metastatic Event Status & Patient TreatmentResponse & Recurrence Status & Sample Recurrence Status & Survival Status;Molecular Subtype : Biomarker; Sample Type : Clinical Specimen; Data Type:mRNA" ，检索参数为 p < 0.05 ，fold change>1.5。统计结果以 box plot 的形式输出（图 1）。

乳腺癌组织,成组,芯片,蜡块

2.3.3 乳腺癌标本收集及乳腺癌组织芯片制作409 例病理标本取自 1998 年至 2008 年于中国医科大学附属第一医院手术的乳腺癌患者，409 例病理标本包括乳腺组织 35 例、乳腺癌组织 315 例、淋巴结反应性增生 29 例,淋巴结转移癌 30 例，本研究在中国医科大学附属第一医院伦理委员会进行备案。将 409 例乳腺癌组织标本制作成组织芯片（技术上由上海芯超生物科技有限公司提供）（图 2），简要制作步骤如下：存档蜡块经病理专家复诊及组织定位后，应用组织阵列仪在空白的受体蜡块上钻孔(直径1mm)，然后在原始蜡块上穿刺，每个石蜡标本取两点(直径为 1mm)，放入受体蜡块孔内，直至将所有组织标本全部种植于受体蜡块中，制作成阵列块；应用切片机连续切片，厚度为 4 微米；捞片，烤片后，再次由病理科教授进行审查确认，证实每个肿瘤样本均为乳腺癌标本，并对病理组织学类型进行会诊，制作成可供免疫组化染色使用的组织芯片数张。

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图 5Oncomine 数据库分析 FEN1 与乳腺癌分子分型的相关性A．FEN1 mRNA 高表达与 ER 阴性正相关，B．FEN1mRNA 高表达与三阴性正相关.2应用在线数据Kaplan Meier plotter分析FEN1 mRNA表达与乳腺癌患者预后利用在线数据库Kaplan Meier plotter对FEN1在乳腺癌患者中的预后进行分析。部乳腺癌患者的生存分析结果显示，FEN1 高表达患者的 RFS 缩短（HR=1.69，<1E-16），DMFS 缩短（HR=1.38，p=0.0018），OS 缩短（HR=1.6，p=0.00011）（图）；ER 阳性乳腺癌患者的生存分析结果显示，FEN1 高表达患者的 RFS 缩短HR=1.64，p=3.3E-8），DMFS 缩短（HR=1.76，p=0.0023），OS 缩短（HR=2.15，=0.00038）（图 7）；ER 阳性接受他莫昔芬辅助内分泌治疗的乳腺癌患者生存分析果显示，FEN1 高表达患者的 RFS 缩短（HR=1.73，p=0.00055），DMFS 缩短HR=1.97，p=0.012），OS 缩短（HR=1.59，p=0.29）（图 8）；三阴性乳腺癌患者生

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