熊胆粉对原发性肝癌TACE术后炎性因子及血管生成的影响

发布时间：2020-09-12 11:16

　　研究背景经导管动脉化疗栓塞术(TACE)是原发性肝癌的主要治疗方法之一,由于术中栓塞剂阻塞及化疗药物等作用,可造成肝脏局部缺血缺氧,致缺血区中性粒细胞、单核细胞、肝脏库弗氏细胞等大量聚集引起炎症反应,多种炎性因子大量生成分泌。炎性因子与肝癌的发生、发展密切相关。其中IL-8、TNF-α与肝癌的进展、血管生成和转移密切相关。TACE术后局部为缺氧环境,可上调缺氧诱导因子(HIF)-1α表达,进一步可通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)升高而促进肿瘤血管生长,进而促进肿瘤复发、转移,VEGF和HIF-1α是缺氧环境中调控血管生成的关键因子,VEGF的高表达可以促进肿瘤生长、增加转移机率。抑制VEGF表达水平是降低肝癌TACE术后复发转移率的重要手段,进而可阻止肿瘤新生血管的形成。在缺氧环境下,VEGF除受HIF-1α调控外,炎性因子亦可以促进VEGF表达。众多研究表明,中药医已经成为恶性肿瘤治疗策略中的重要组成部分,配合TACE术具有良性调节作用,不仅可减轻栓塞综合征,而且可以在降低肝癌复发、转移方面发挥作用。清热解毒法是中医治疗原发性肝癌的主要治疗方法之一,清热解毒中药在肝癌发展的不同阶段均有一定疗效。熊胆粉作为清热解毒类中药,具有抗炎、抗肿瘤的作用。现研究发现,熊胆粉在减少炎性因子分泌、调节肿瘤微环境、抑制肝星状细胞活化、促进T细胞增殖、诱导肝肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖及血管生成等方面均有作用。熊胆粉是否可能下调TACE术后缺氧环境炎性因子分泌,是否可以下调VEGF表达,是否可以抑制缺氧条件下的血管生成,目前尚无相关报道。研究目的探讨熊胆粉对原发性肝癌TACE术后炎性因子及栓塞综合征的影响,并进一步探讨熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞炎性因子及血管生成的影响,为熊胆粉配合TACE术进一步提高TACE术的疗效提供实验依据。研究方法1、熊胆粉对原发性肝癌患者TACE术后血清炎性因子及栓塞综合征的影响将符合纳入标准的107例原发性肝癌患者随机分为熊胆粉组(服用熊胆粉胶囊)及对照组(服用安慰剂),均于TACE术前1天开始用药,疗程6天,分别于术前、术后第3天及术后第5天检测并记录患者血清炎性因子、肝功水平及记录临床症状情况。2、熊胆粉对CoCl_2诱导的SMMC-7721肝癌细胞IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响体外采用CoCl_2造成人肝癌细胞SMMC-7721缺氧模型,MTT检测不同浓度熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞增殖的影响,然后用对SMMC-7721肝癌细胞无明显毒性的低、中、高浓度的熊胆粉干预,RT-PCR方法检测缺氧条件下熊胆粉对肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGF表达,同时用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清中IL-8水平、Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,探讨熊胆粉在缺氧条件下对IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响。3、熊胆粉对IL-8诱导的血管生成的影响在体外实验中,我们用铺基质胶方法将100 ng/mL IL-8与内皮细胞注入高浓度的基质胶内,并加入不同浓度的熊胆粉培养,在荧光显微镜下观察血管结节数量、血管长度及面积并拍照,图片采用Image J软件进行处理并统计其血管生成情况。在体内实验中,将裸鼠分3组,分别为空白组(裸鼠皮下接种基质胶与内皮细胞)、IL-8组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞与IL-8混合液)、IL-8+熊胆粉组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞、IL-8与0.4 mg/mL熊胆粉混合液),将混有IL-8、EA.hy 926细胞、熊胆粉的基质胶按分组设计方案接种于裸鼠体内。10天后,将裸鼠皮下基质胶团块剥离,一部分置于EP管中,加入Lysis细胞裂解液并在组织研磨机中研磨,通过BCA法检测蛋白浓度,将所有样品调整至相同蛋白浓度后,将所获得的组织悬液通过贝博血红蛋白检测试剂盒进行血红蛋白浓度的检测;另一部分用于HE染色观察血管生成情况,免疫组化检测CD31、VEGF表达以评估血管生成情况。研究结果1、临床研究发现,原发性肝癌患者TACE术后炎性因子IL-6、CRP、IL-8表达明显上调(P0.05),术后第5天时熊胆粉组IL-8、TNF-α水平明显低于对照组(P0.01,P0.05),提示熊胆粉可以抑制TACE术后炎性因子IL-8、TNF-α表达水平;2、原发性肝癌患者TACE术后肝功TBIL、DBIL、ALT、AST水平升高,熊胆粉组AST/ALT比值、AST水平显著低于对照组(P0.01,P0.05);熊胆粉组患者的发热持续时间明显短于对照组(P0.05),提示熊胆粉可以改善TACE术后肝功能损伤,减轻发热症状,减轻栓塞综合征。3、RT-PCR方法检测肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,结果发现,CoCl_2能显著诱导SMMC-7721细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.01),而熊胆粉能够明显抑制CoCl_2诱导的SMMC-7721肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA的表达。进一步采用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清液中IL-8水平,结果与mRNA结果一致。Western blot法检测肝癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达,结果也显示熊胆粉可抑制HIF-1α、VEGF蛋白表达,以上均提示熊胆粉具有抑制缺氧条件下IL-8、HIF-1α、VEGF表达的作用。4、熊胆粉体外对IL-8诱导的血管生成的影响,结果显示:混有IL-8及内皮细胞的基质胶内血管结节数量、血管长度及面积方面均明显高于空白对照组(P0.05),提示IL-8能刺激血管的生成;加入不同浓度的熊胆粉干预后,血管结节数量、血管长度及面积三个指标均较IL-8组下降,其中0.2、0.4mg/mL两组与IL-8组差异显著(P0.05),提示熊胆粉能有效抑制IL-8促血管生成的效应,并且呈一定的剂量依赖性。5、熊胆粉对体内血管生成的影响的实验中,HE染色观察发现基质胶团块血管生成在IL-8刺激下明显增加,而熊胆粉能有效抑制该效应;免疫组化检测体内基质胶内CD31、VEGF表达的结果发现,IL-8组CD31、VEGF表达明显高于对照组,而熊胆粉+IL-8组则CD31、VEGF表达均较IL-8组明显减少,检测体内基质胶内血红蛋白浓度发现,在IL-8诱导下,IL-8组基质胶内血管较空白对照组丰富,血红蛋白浓度明显高于空白对照组,差异显著(P0.05),而熊胆粉+IL-8组则血管不明显,血红蛋白浓度明显低于IL-8组,差异有统计学意义(P0.05),以上均提示熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成。结论1、熊胆粉可以抑制TACE术后IL-8、TNF-α表达水平;降低术后AST水平,减轻TACE术后栓塞综合征;2、熊胆粉能够抑制缺氧诱导的肝癌细胞VEGF、IL-8水平升高;3、熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成;4、熊胆粉可能能够抑制原发性肝癌TACE术后缺氧诱导的血管生成,其机制可能与抑制HIF-1α/IL-8/VEGF相关。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

炎性因子,熊胆粉,术前,患者

粉组患者IL-8及TNF-α水平均低于对照组，有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。（见图1-2）图1-2. 肝癌患者TACE术前及术后炎性因子表达情况A. TACE术前；B. TACE术后第3天；C. TACE术后第5天；BBP，熊胆粉组；Control，对照组；*P<0.05,**P<0.01 vs 术前；#P<0.05,##P<0.01 vs 同时间点对照组2、肝功能（1）TACE术前两组患者TBIL、DBIL、ALT、AST、ALB、AST/ALT水平无明显差异（P＞0.05）；（2）术后第3天：两组患者TBIL、DBIL、ALT、AST水平升高，与术前比较差异显著（P＜0.05）；熊胆粉组AST/ALT值明显低于对照组（P＜0.05）；（3）术后第5天：两组患者TBIL、DBIL仍较术前升高（P＜0.05）；熊胆粉组AST/ALT比值、AST水平显著低于对照组（P＜0.01，P＜0.05）。（见图1-3）

功能图,熊胆粉,功能,情况

海军军医大学博士学位论文- 30 -图1-3. 肝癌患者TACE术前及术后肝功能情况A. TACE术前；B. TACE术后第3天；C. TACE术后第5天；BBP,熊胆粉组；Control，对照组；*P<0.05,**P<0.01，vs 术前；#P<0.05,##P<0.01 vs 同时间点的对照组3、TACE术后栓塞综合征TACE术后对照组患者出现41例发热、8例恶心、28例腹痛，熊胆粉组出现39例发热、10例恶心、22例腹痛，两组患者在常见症状强度方面比较无显著差异（P＞0.05）；熊胆粉组患者的发热持续时间明显短于对照组（P＜0.01）；而两组间恶心及腹痛持续时间则无显著差异（P＞0.05）。（见表1-11）表1-11 TACE术后栓塞综合征组别症状症状强度（例/%) 时间Ⅰ Ⅱ Ⅲ 合计（ ±S h)对照组（n=56）发热 7（12.5） 34（60.7） 0 41（73

功能图,熊胆粉,功能,情况

【参考文献】