小白菊内酯对胃癌耐药逆转作用及机制

发布时间：2020-09-17 21:26

　　 目的:胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一,我国的胃癌发病率高、转移率高、死亡率高和早诊率低、根治切除率低、5年生存率低等特点。进展期胃癌的治疗是我们面临的巨大挑战。小白菊内酯(Parthenolide,PTL)是分离自艾菊、篙属、观光木、欧洲小白菊等药用植物,具有抗炎、抗病毒、氧化应激、诱导凋亡、抗肿瘤及免疫调节等作用。对于来自血液、肠道、肝脏,乳腺,前列腺,血液等的多种肿瘤细胞的增殖有抑制效应。小白菊内酯可通过抑制NF-κB信号通路,发挥其抗肿瘤侵袭、转移、药物抗性等作用,且PTL基本不损伤正常细胞,故PTL在将来肿瘤治疗中具有重大意义,但目前,PTL对胃癌的抗肿瘤及化疗耐药等研究方面较少,为了探讨PTL在逆转胃癌化疗耐药中的作用,我们通过研究PTL对胃癌细胞SGC7901对顺铂(DDP)的敏感性的影响;以及胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP、SGC7901/ADR耐药性的影响,并通过对P-gp、MRP、Bcl-2、Cyclin D1、NF-κB、Caspase-8表达及活性检测,探讨PTL是否可增加胃癌细胞对顺铂的敏感性,以及逆转胃癌耐药细胞多药耐药的作用及其机制。研究方法:本研究利用MTT法检测PTL、DDP、ADR单独及联合对胃癌细胞的增殖抑制率的影响,培养胃癌细胞株SGC7901、SGC7901/DDP、SGC7901/ADR细胞株,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL、DDP、ADR、PTL+DDP、PTL+ADR,对照组则加等量培养液,干预48小时后,检测吸光度(OD)值并计算增殖抑制率。并用流式细胞仪检测PTL、DDP、ADR单独及联合对胃癌细胞的凋亡的影响,消化收集PTL、DDP、ADR、PTL+DDP、PTL+ADR处理48h的SGC7901、SGC7901/DDP、SGC7901/ADR细胞,AnnexinV-FITC/PI染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。采用体外逐步增加顺铂药物浓度反复间歇诱导法,建立胃癌顺铂耐药株SGC7901/DDP。并采用MTT法测定SGC7901/DDP、SGC7901/ADR对各种化疗药物的耐药指数,观察冻存、撤药对SGC7901/DDP耐药性的影响。Western blot方法检测P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1蛋白的表达。收集对照组、PTL、DDP、PTL+DDP处理48h的SGC7901细胞蛋白,用Western blot方法检测Bcl-2蛋白的表达。收集不同浓度PTL处理48h的SGC7901/DDP、SGC7901/ADR细胞蛋白,以未处理的SGC7901细胞蛋白为对照组,检测P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1蛋白的表达。EMSA检测NF-κB活性,收集对照组、PTL、DDP、PTL+DDP处理48h的SGC7901细胞蛋白,电泳迁移率实验(EMSA)检测NF-κB DNA-蛋白结合活性。收集不同浓度PTL处理48h的SGC7901/DDP、SGC7901/ADR细胞,以未处理的SGC7901细胞为对照组,电泳迁移率实验(EMSA)检测NF-κB DNA-蛋白结合活性。分光光度法检测Caspase-8的活性,收集对照组、PTL、DDP、PTL+DDP处理24h、48h的SGC7901细胞,分光光度法检测Caspase-8的活性。本研究结果均以mean士SD表示,应用t检验进行两组间比较。方差分析进行多组间比较采用,应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。结果:PTL对SGC7901细胞有增殖抑制作用,小剂量PTL可增加DDP的药物敏感性。小白菊内酯和顺铂抑制SGC7901细胞作用呈浓度依赖关系,PTLIC50为17.4±1.04μmol/L,DDPIC50为2.61±0.26mg/L,PTL10μmol/L与DDP联用时对SGC7901细胞的增顺殖抑制率显著高于铂单独用药,显著降低DDP的半数抑制浓度,IC50为0.86±0.07mg/L。PTL可诱导SGC7901细胞凋亡,PTL与DDP合用可显著增加DDP诱导凋亡作用。与对照组凋亡率(10.65%±2.12%)比较,10μmol/L PTL及2mg/LDDP诱导SGC7901细胞凋亡增加20.16%±2.22%(P0.05)、26.14%±3.03%(P0.05),联合应用时凋亡率显著增加67.14%±5.52%(P0.01)。PTL可通过抑制NF-κB激活,抑制Bcl-2的表达,上调Caspase-8的活性,抑制SGC7901细胞增殖及诱导其凋亡。并通过抑制DDP诱导的NF-κB激活,抑制Bcl-2的表达,上调Caspase-8的活性,增加DDP对胃癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡能力。对照组、PTL、DDP、PTL+DDP四组细胞的NF-κB、Caspase-8的活性,Bcl-2的表达进行检测,结果显示,与对照组比较,DDP组的NF-κB活性显著增加(P0.01),Bcl-2的表达及Caspase-8的活性无显著差异(P0.05);PTL组NF-κB、Caspase-8的活性显著降低(P0.01),Bcl-2的表达下调(P0.01);PTL+DDP组与对照组及DDP组比较NF-κB、Caspase-8的活性显著降低(P0.01),Bcl-2的表达显著下调(P0.01)。建立SGC7901/DDP耐药细胞株,SGC7901/DDP耐药指数为13.46,加药-196℃冻存4mo复苏后其RI仍维持冻存前水平,耐药可持续性的研究表明在脱药细胞传代培养情况下,细胞自第8代耐药性开始显著下降。SGC7901/DDP具有多药耐药性,各类临床常用化疗代表药物ADR、DNR、MMC、VCR、VP-16和5-FU的耐药指数分别为9.41,8.54,11.74,6.77,13.41和8.88。PTL以浓度依赖的方式抑制SGC7901/DDP、SGC7901/ADR细胞增殖(P0.05),半数抑制率分别为22.61±2.55μmol/L、23.35±3.02μmol/L。10μmol/L PTL可逆转耐药细胞耐药性。PTL10μmol/L可增加DDP、ADR对SGC7901/DDP、SGC7901/ADR细胞的增殖抑制率(P0.01),显著降低DDP、ADR的半数抑制浓度,DDP IC50由35.1士3.24mg/L降至2.1士0.27mg/L,ADR IC50由29.21士2.67mg/L降至1.41士0.22mg/L。PTL可诱导胃癌耐药细胞凋亡,亦可显著增加DDP、ADR对胃癌耐药细胞诱导凋亡作用。与对照组凋亡率(6.88%±1.14%)比较,10μmol/L PTL诱导SGC7901/DDP细胞凋亡率为19.33%±2.51%(P0.05),2mg/LDDP诱导SGC7901/DDP细胞凋亡率为9.76%±1.78%(P0.05),联合应用时凋亡率显著增加34.64%±3.9%(P0.01)。与对照组凋亡率(6.04%±1.33%)比较,10μmol/L PTL诱导SGC7901/ADR细胞凋亡率为20.24%±2.65%(P0.05),2mg/LADR诱导SGC7901/ADR细胞凋亡率为8.53%±1.66%(P0.05),联合应用时凋亡率显著增加38.65%±4.79%(P0.01)。胃癌耐药细胞的耐药性与NF-κB的活化,耐药相关基因的表达增加有关;PTL可通过抑制NF-κB的活化,从而抑制耐药相关基因P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表达来逆转胃癌耐药。对照组(SGC7901)、SGC7901/ADR经PTL5、10、15μmol/L,SGC7901/DDP经PTL5、15μmol/L,干预48h,检测NF-κB的活性,P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表达,研究显示,与对照组比较,SGC7901/DDP和SGC7901/ADR的NF-κB的活性明显很高(P0.01),P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表达亦显著增加(P0.01);小白菊内酯可明显抑制SGC7901/DDP和SGC7901/ADR细胞中组NF-κB的活性,及细胞中P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表达(P0.01),其抑制作用随着PTL浓度增加而增强(P0.01)。结论:1、小白菊内酯以浓度依赖的方式抑制SGC7901细胞增殖并诱导凋亡,且可通过抑制DDP诱导的NF-κB活化,下调Bcl-2,激活Caspase-8,从而增加DDP对胃癌细胞的化疗敏感性。2、SGC7901/DDP细胞具有稳定的多药耐药性,并不受冻存及7代之内的脱药传代影响。3、小白菊内酯可浓度依赖性通过抑制胃癌耐药细胞SGC7901/DDP、SGC7901/ADR中NF-κB的活化,从而调节Bcl-2、CyclinD1、P-gp、MRP的表达,抑制胃癌耐药细胞SGC7901/DDP、SGC7901/ADR的增殖及诱导细胞凋亡,逆转胃癌耐药细胞的耐药性。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

PTL、DDP 单独及联合作用对 SGC7901 细胞增殖的影响(mean±SD,n=3)PTL 浓度μmol/L细胞抑制率(X±S )%DDP 浓度 mg/L细胞抑制率(X±S )%PTL10μmol/L+ DDP(mg/L)细胞抑制率(X±S )%0（对照） 0.00±0.00 0 0.00±0. 00 0 0.00±0. 005 14.12±1.35* 0.5 9.12±2.71 0.5 32.22±2.33*#10 28.22±2.51* 1.0 20.64±2.65* 1.0 56.12±4.21*#15 43.83±3.33* 2.0 33.93±3.41* 2.0 78.11±2.69*#20 57.82±0.96* 3.0 52.82±3.35* 3.0 88.65±3.45*#30 64.11±1.65* 4.0 58.11±2.67* 4.0 90.22±1.01*#50 83.33±0.88* 5.0 73.33±1.34* 5.0 91.35±1.22*#100 91.66±0.63* 10.0 89.66±0.88* 10.0 95.11±0.77*#*P<0.01vs 对照组，# P<0.01 PTL10μmol/L+ DDP 组 vs DDP 组

与对照组的凋亡率（10.65%±2.12%）比较，顺铂及小白菊内酯诱导SGC7901 细胞凋亡率明显增加分别为：20.16%±2.22%、26.14%±3.03%，与有显著性差异（P<0.05）。DDP 联合 PTL 组凋亡率为 67.14%±5.52%，与对照组及顺铂及小白菊内酯单独用药组凋亡率比较，有显著性差异（P<0.01），(见表 2，图 2)。结果提示，PTL 及 DDP 可单独诱导 SGC7901 细胞凋亡，PTL 亦可显著增加 DDP 对SGC7901 细胞的凋亡诱导作用。表 2，PTL、DDP 单独及联合作用对 SGC7901 细胞凋亡的影响(mean 士 SD,n=3)分组 对照 PTL DDP PTL+DDP凋亡率10.65%±2.12% 20.16%±2.22%* 26.14%±3.03%* 67.14%±5.52%*#*P<0.01vs 对照组 # P<0.01vs DDP 组

BTL、DDP 单独及联合作用对 SGC7901 细胞 NF-κB 活的 EMSA 图片，B：EMSA 灰度值柱状图，*P<0.01v 单独及联合作用对 Bcl-2 表达的影响认为是细胞凋亡的最后调控通路之一，大多数利用 Western-blot 方法检测 SGC7901 细胞对照组0μmol/L）组以及 PTL（10μmol/L）联合 DDP(2 4，对照组及 DDP 组 Bcl-2 呈高表达，与对照组达（P<0.01），DDP 组的 Bcl-2 表达无显著差异明显低于对照组及 DDP 组（P<0.01）。研究结

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