酒精上调CCL5表达通过激活AMPK通路诱导自噬促进结直肠癌转移

发布时间：2020-09-24 21:04

　　 研究背景:结直肠癌(colorectal cancer CRC)是一种发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤。全球范围内,肠癌每年导致约600,000人死亡,约占癌症死亡总数的8%。结直肠癌在男性癌症患者中的发病率中高居第三位,而在女性癌症患者中,发病率甚至高居第二位。以往的调查认为结直肠癌主要高发于发达国家,发病年龄约在50-60岁;而近期的调查显示,发展中国家肠癌的发病率呈现出上升趋势,而且发病年龄也呈现年轻化。CRC发病因素复杂,确切的致病因素仍然不明;目前认为引起肠癌发生发展的原因主要包括环境和遗传因素两大类。15%-30%的CRC患者具有明确的家族遗传病史,如家族腺瘤性息肉病、遗传性非息肉性肠癌,均可通过引起染色体畸变而引起肠癌。而环境因素在肠癌的发病中的作用越来越得到重视,如人种地域的分布差异、营养物质的过度摄入、肥胖、肠道菌群的失调、吸烟、饮酒等;不仅可以诱发肠癌,而且对肠癌的发展也可能起到了促进作用。饮酒与疾病之间的发展关系复杂,虽然有研究表明,适量的饮酒对人体健康有益;但是越来越多的研究证实,饮酒与多种疾病的发生发展相关。过去40年中,全球人均饮酒量上升了约一倍,而在亚洲地区上升的尤为明显。统计学显示约3.6%的癌症发生与慢性饮酒有关,酒精可以通过引起细胞色素酶的增高从而增强前致癌物如含酒精性的饮料、烟草、高脂饮食、化学致癌物质等致癌作用;酒精通过乙醇脱氢酶的而产生的一级代谢产物是乙醛,乙醛可以通过引DNA的甲基化从而引起DNA的损伤。酒精可以引起氧化应激反应,产生的活性含氧物质可以引起脂质体的过氧化,过氧化产物如4羟基壬烯酸可以引起DNA的突变;而近期研究表明,饮酒可以加速癌症患者病程的进展,其中就包括可以引起癌细胞的转移。肿瘤转移引起癌症患者死亡率增高的重要原因之一,统计数据表明,肠癌手术后五年生存率约在66%左右;而一旦发生转移(包括临近器官的浸润转移,血运系统和淋巴系统的转移及器官的种植转移),术后的五年生存率将仅仅只有20%。因此,明确酒精是否促进了CRC的转移,并调查其发病机制尤其重要。趋化因子,顾名思义,是一类对细胞有趋化作用的分子蛋白;共同特点包括:分子量小(约8-10千道尔顿)、化学结构稳定、其三级结构由四个半胱氨酸残基组成。自1987年第一个趋化因子CXCL8(IL-8)被发现以来,陆续有约50种趋化因子和20多种趋化因子受体被发现。多种细胞如巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞以及肿瘤细胞本身均可分泌趋化因子;而多种细胞表面均有趋化因子受体的表达。C-C趋化因子配体5(CCL5)是趋化因子的一种,可以由T淋巴细胞、巨噬细胞、血小板、滑膜成纤维细胞、管状的上皮细胞和某些肿瘤细胞自身分泌。CCL5在肿瘤生物学中的确切作用尚未完全阐明,CCL5可以引起适当的免疫反应,从而抑制肿瘤的生成;但是同时又与肿瘤的发展和转移密切相关。目前研究表明,CCL5和其受体相互作用后,可以促进肿瘤细胞的增值、迁徙、侵袭;直接的或者间接的招募T调节细胞,抑制CD8细胞的杀伤效应形成肿瘤细胞的免疫逃逸;促进肿瘤微血管的形成和骨转移,从而促进疾病的进展。肿瘤细胞的转移(包括临近器官浸润转移,血运和淋巴结转移,种植转移)是肿瘤发展的重要特征之一;肿瘤的转移需要肿瘤细胞迁移能力的增加,并且需要能量支持。肠肿瘤细胞多为上皮来源,肿瘤细胞一旦发生上皮细胞和内皮细胞在形态学上向间充质细胞表型的转变,迁移能力将增加,这已经被广泛报道。近年来越来越多的研究表明,细胞自噬和肿瘤的转移有关。细胞自噬是一种进化上高度保守生物学进程;环境的变化或细胞内能量不足时,通过自噬相关基因和复杂信号传导通路调控的细胞内自我消化,提供维持细胞生存所需氨基酸和脂肪酸等能量支持。自噬与肿瘤之间存在相关性,许多研究表明自噬不仅具有肿瘤抑制的功能,也可以促进肿瘤的存活。在正常组织中,自噬维持着组织的稳态;一旦自噬被抑制,组织正常的代谢被打破,将导致基因的不稳定性、炎症反应、和非整倍性(在减数分裂的过程中同源染色体不分离而造成的一条或多条染色体的缺失或增加)得增加,这将增高肿瘤的发生率,对肿瘤早期形成起到促进作用。但是如果自噬持续性缺失的话,肿瘤发生的进程也将被阻断。相反的是如果在肿瘤形成后期,肿瘤的生长需要大量的能量支持,此时如果自噬被激活,则可以通过对营养物质的回收再利用,促进肿瘤细胞的增殖、转移,增加其对化疗药物的抵抗作用,对肿瘤细胞起到一定的保护作用。研究表明,正常乳腺组织中,氧含量和糖原含量分别为10KP和5n M;而乳腺癌组织中为4KP和0-2n M,可见肿瘤的生存环境十分恶劣;此时一旦自噬被激活,可以为肿瘤细胞提供额外的营养支持,从而进一步促进肿瘤的发展的进程。本实验室在前期研究中发现,酒精可以刺激多种癌症如肺癌、肝癌、肠癌细胞的恶性生物学行为;有研究表明酒精可以引起多种细胞因子和趋化因子分泌增多。那么饮酒和肠癌疾病进展之间是否存在相关性?在饮酒的肠癌患者病程中,趋化因子CCL5起到了哪些作用?是否通过引起肠癌细胞的自噬从而参与了肿瘤转移的调节?本课题将结合肠癌患者的饮酒病史,调查饮酒和肠癌进展之间的关系。通过调查CCL5在饮酒和非饮酒肠癌患者临床病理标本的表达,酒精体外刺激CRC细胞株,研究酒精和CCL5表达的关系。通过人为改变CCL5表达水平,体外实验观察对血管内皮细胞的血管形成,观察CCL5对CRC细胞在增殖、周期、凋亡及转移的变化情况的影响。通过生物信息学预测以及分子实验,验证CCL5是否可以引起自噬;自噬增高及阻断自噬后,对CRC细胞迁移能力的影响;并进一步调查其分子机制。探讨CCL5在酒精促进的肠癌进展中的作用,为CRC的临床治疗提供新的线索。研究目的:本课题探讨CCL5在饮酒的肠癌患者疾病进程中的作用,并进一步揭示其致病的分子机制。研究内容:1.选取安徽医科大学第一附属医院2012年全年手术治疗的肠癌患者病例,通过统计分析,调查饮酒和肠癌进展,患者术后五年生存率的关系。通过病理切片进行免疫组化,检测CCL5在饮酒患者和非饮酒患者病理组织中的表达情况。2.RT-PCR检测HT29、DLD-1、RKO和SW480肠癌细胞株酒精刺激前后,CCL5m RNA的表达情况。3.ELISA检测酒精刺激前后,检测HT29、DLD-1、RKO和SW480肠癌细胞株CCL5分泌的变化。HT29和DLD-1细胞在酒精刺激后CCL5的分泌增多,因此选取HT29和DLD-1细胞株进行后续的研究。4.血管形成实验观察CCL5对人脐静脉内皮细胞的血管形成能力的影响。5.酒精慢性刺激两周以后,RT-PCR和Western bolt检测HT29和DLD-1细胞中CCL5表达情况;ELISA检测CCL5分泌情况。6.给予HT29和DLD-1细胞不同浓度CCL5慢性刺激两周,随后:(1)MTT法检测HT29和DLD-1细胞株的细胞增殖,并绘制生长曲线图。(2)流式细胞仪检测HT29和DLD-1细胞株的细胞周期。(3)Annexin V/PI法检测HT29和DLD-细胞株的凋亡。(4)平板克隆形成实验观察单个细胞的体外增殖能力。(5)软琼脂半固体集落形成法观察细胞独立性非锚定生长能力。(6)Transwell法观察细胞的迁移能力。7.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1细胞,透射电镜(transmission electron microscope TEM)观察自噬体形成的情况。通过Western bolt法,检测LC3B和p62蛋白的变化,并结合CQ阻断自噬,检测自噬流的情况。同时结合免疫荧光实验,证实自噬流的存在。8.抑制自噬后,观察CCL5引起的细胞迁移能力的增加和细胞自噬之间的关系。9.高通量测序(High-throughput sequencing)结合生物信息学技术,筛选出自噬通路中可能存在的分子通路,并通过Western blot技术进行验证;同时通过阻断该通路,进行反向验证。10.阻断该自噬信号通路,观察CCL5引起的细胞迁移能力的增高和该自噬通路之间的关系。研究结果:1.通过对102CRC患者临床病例分析及电话随访,发现饮酒和肿瘤的恶性程度分级,TNM分期,转移均有相关性(P0.05);饮酒的肠癌患者术后5年生存率更低(P0.01)。2.HT29、DLD-1、RKO和SW480肠癌细胞株基础水平均表达并分泌CCL5,酒精刺激肠癌细胞后,HT29和DLD-1细胞的CCL5分泌较基础水平有明显的增高(P0.05)。临床病理切片显示,饮酒患者癌和癌旁组织中的CCL5表达量较非饮酒患者有明显增高(P0.05)。3.CCL5对人脐静脉内皮细胞的血管形成能力没有明显的影响。4.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1细胞两周后,发现对肠癌细胞的增殖、周期、凋亡没有明显的影响;但是可以上调肠癌细胞的迁移能力(P0.01)。慢性酒精刺激引起HT29和DLD-1细胞迁移能力的增高,可以被CCL5Ab抵消;而敲除了酒精刺激引起的CCL5高表达的肠癌细胞,迁移能力也明显降低。5.CCL5慢性刺激HT29和DLD-1细胞,通过TEM观察,可以发现自噬体形成增多。通过Western blot、免疫荧光技术,结合自噬阻断剂,证明了自噬流的存在并且通畅。而阻断了自噬,肠癌细胞的迁移能力随之下降。6.高通量测序(High-throughput sequencing)技术结合生物信息学分析结果,提示CCL5通过AMPK信号通路中的AMPK Thr172发生磷酸化,从而引起自噬。阻断AMPK的磷酸化,不仅可以阻断自噬,同时对CCL5引起的细胞迁移能力的增加有一定程度的抵消作用。结论:1.饮酒促进肠癌病程的进展。2.CCL5在酒精引起HT29和DLD-1细胞迁移能力上调中起到了重要的作用。3.CCL5通过AMPK通路引起自噬,从而上调HT29和DLD-1细胞的迁移能力。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：

46图 1 肠癌患者术后五年生存率和饮酒的关系。饮酒肠癌患者的术后五年生存率明显降低。Figure 1 Survival rates of CRC patients and association of alcohol drinking. The post-op survivalrate within 5 years was shortened in CRC patients’ which with alcohol consumption.

47图 2 酒精刺激前后，CCL5 在肠癌细胞株中，表达和分泌水平变化。a:肠癌细胞给予急性酒精刺激后，CCL5 及 CCR5 的变化；b:肠癌细胞给予急性酒精刺激后，CCL5 分泌的变化；c:酒精慢性刺激后，HT29 和 DLD-1 细胞中 CCL5 的 mRNA 和蛋白水平均有上调；d:酒精慢性刺激后，HT29 和 DLD-1 细胞分泌 CCL5 的水平较对照组有明显增高。每组实验独立重复检测三次，（*P<0.05 **P<0.01 #P>0.05 n=3）。Figure 2 Effect of EtOH on CCL5 expression and secretion in colorectal cancer cells.a-b: Colorectal cancer cells were exposed to EtOH (200 mg/dl) for indicated time. ThemRNA levels of CCL5 and CCR5 were analyzed by RT-PCR and GAPDH mRNA wasshown as a loading control. The secreted CCL5 in conditioned medium was assayed byELISA（*P<0.05）. c-d: HT29 and DLD-1cells were exposed to EtOH (200 mg/dl) for 14days. The mRNA and protein levels of CCL5 were measured by RT-PCR and Western blot.The secreted CCL5 in conditioned medium was assayed byELISA. Each data point was themean±SEM of three independent experiments and presented relative to the control values.（*P<0.05**P<0.01 #P>0.05 n=3）.

3.3 CCL5 对上皮细胞的血管形成率无明显影响图 3 饮酒和非饮酒肠癌患者病理标本中 CCL5 的表达 a:免疫组化显示 CCL5 在饮酒，非饮酒的肠癌患者的癌和癌旁病理组织中的表达情况；b:统计学分析显示饮酒患者癌和癌旁组织中的 CCL5 的表达均高于非饮酒患者（*P<0.05）。Figure 3 The expression of CCL5 in CRC patients’ tumor tissues whose with alcolhol consumptionor not. a: The expression of CCL5 in CRC patients’ tumor tissues was measured by IHC. b:The expression of CCL5was measured by MOD. *P<0.05

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Pablo Iribarren;;Chemokines and Chemokine Receptors:Their Manifold Roles in Homeostasis and Disease[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年02期

本文编号：2826276