MiR-23b靶向调控PDE7A在结肠癌中作用和相关机制研究

发布时间：2020-09-27 17:17

　　研究背景:结肠癌(coloncancer)是发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,好发于直肠与乙状结肠交界处,是临床上非常常见的消化道恶性肿瘤,发病率一直以来居高不下,居于全球肿瘤发病率的第三位,且由于人们生活水平的提高,饮食习惯的改变,多脂肪多肉类和多胭脂食物等饮食摄入增加,生活节奏日益加快,工作压力加大以及环境污染等因素,导致结肠癌发病率逐年增高。而另一方面,虽然医疗技术不断进步,对结肠癌的诊断和治疗的方法越来越多样化,手术,放疗,化疗以及靶向治疗等各种综合治疗手段不断提高,且治疗手段越来越趋向个体化趋势,但是结肠癌的治疗效果仍旧未见明显改善,早期手术干预结肠癌效果较好,五年生存率可达90%,但晚期结肠癌患者手术干预效果欠佳,晚期结肠癌术后并结合化疗辅助治疗的结肠癌患者五年生存率仅占20%左右,结肠癌的死亡率仍旧较高,居于全球肿瘤死亡率的第三位。肿瘤转移的机制十分复杂,涉及肿瘤细胞的浸润和粘附,上皮间质转化(EMT),细胞外基质的降解,血管生成和微环境的趋化作用。受许多癌基因或抑癌基因的异常激活或失活及相关信号通路的影响。癌基因或抑癌基因的激活或失活分别在转录水平、转录后水平和翻译水平上调节。研究表明,miRNAs可以参与调节至少30%的人类蛋白编码基因的表达,并且比较编码蛋白质基因而言,可以发挥更大的作用。在各种人类肿瘤中,miRNAs的主要特征是基因突变或基因脆性位点的异常表达,进而证实miRNAs与肿瘤的发生和进展相关。miR-23b已经被证实在肝癌细胞中的异常表达,从而降低肝癌细胞增殖迁移能力。microRNA-23b在不同肿瘤中表达各有不同,在某些肿瘤中表达增加,有的肿瘤组织中表达下降,因此认为部分肿瘤中microRNA-23b起到原癌基因的作用,而部分肿瘤中是抑癌基因。因此在肿瘤中miR-23b表达具有特异性,但在肿瘤的进展中具有双重特异性。而另外的一些研究发现,miR-23b与肿瘤药物治疗中的耐药性和敏感性相关,可作为药敏性靶点;且miR-23b可多向调控靶基因,有利于肿瘤的诊断,治疗和预后。在肿瘤的预后中,miRNA作为肿瘤标志物显得尤为重要,而miR-23b可作为多种肿瘤的预后标记物。磷酸二酯酶(PDEs)的主要作用是针对细胞内第二信使进行水解。第二信使包括环磷酸腺苷,又称为cAMP以及环磷酸鸟苷,又称为cGMP。PDEs作为新的治疗靶点,引起了众多学者广泛的关注,成为一个新的研究热点。PDE7A是调节细胞水平的cAMP和cGMP的一种磷酸二酯酶。多种肿瘤细胞中可以发现cAMP的低水平表达和PDE7A高水平表达,而PDE7A被发现在淋巴细胞白血病和子宫内膜癌中表达增高,表明PDE7A也可能参与肿瘤的发生发展。本研究目标是探讨miR-23b和PDE7A在结肠癌和结肠癌细胞系中的表达,并通过生物分析软件预测靶基因,利用双荧光素酶报告基因确定靶基因,分析miR-23b及其靶基因在结肠癌中的作用,为临床选择结肠癌的治疗新靶点提供参考依据,为进一步深入研究结肠癌的发生机制提出理论基础。本研究共分为四部分进行:第一部分miR-23b和PDE7A在结肠癌组织和细胞中的表达研究目的:探讨在结肠癌组织和结肠癌细胞系中miR-23b和PDE7A的表达及相关临床意义。研究方法:1选取2016年1月至2016年12月之间的在我院普外科住院治疗的患者,纳入病例共计30例。术后病理组织学检查分别确定肿瘤的分期,类型,分化程度等病理资料。2体外培养SW620和SW480结肠癌细胞系。3实时荧光定量PCR检测新鲜组织及人结肠癌细胞中miR-23b的表达。4实时荧光定量PCR检测新鲜组织及人结肠癌细胞中PDE7AmRNA的表达。5 Western blot分析新鲜组织及人结肠癌细胞中PDE7A蛋白的表达。6 miR-23b和结肠癌病理相关性分析7 PDE7A在和结肠癌病理相关性分析8 miR-23和PDE7A在结肠癌组织中相关性分析。结果:1与癌旁正常组织比较,可见各病理类型结肠癌组织中miR-23b表达呈下调趋势,二者之间差异具有统计学意义(P0.01)。2在高分化结肠癌组织中,miR-23b的表达显著减低,与正常癌旁组织比较具有统计学意义(P0.05),而随着分化程度的降低,miR-23b的表达进一步减低。在TNM分期中,随着TNM分期级别增高,miR-23b的表达进一步减少,与正常癌旁组织比较具有统计学意义,差异具有显著统计学意义(P0.05;P0.01);分析miR-23b表达与结肠癌临床分型相关性,miR-23b的表达降低与结肠癌分化程度呈正相关关系(r=0.625,P0.05),和结肠癌分期呈负相关(r=-0.816,P0.05)。3与癌旁正常组织的PDE7A表达比较,可见各病理类型结肠癌组织中PDE7A表达呈上升趋势,二者之间差异具有统计学意义(P0.01)。4与癌旁正常组织的miR-23b表达比较,结肠癌细胞系SW620和SW480miR-23b表达呈下调趋势,二者之间差异具有统计学意义(P0.01)。5与癌旁正常组织的PDE7A表达比较,结肠癌细胞系SW620和SW480中PDE7A mRNA和蛋白均表达呈上升趋势,二者之间差异具有统计学意义(P0.01)。6PDE7A的表达增加与结肠癌分化程度呈负相关关系(P0.05),PDE7A表达和肿瘤大小呈正相关(P0.05),和结肠癌分期呈正相关(P0.05)。7在结肠癌组织中,miR-23b与PDE7A呈负相关(P0.05)。结论:1.miR-23b在结肠癌组织和结肠癌细胞中表达降低。2.miR-23b的表达降低与结肠癌分化程度呈正相关关系,和结肠癌分期呈负相关。3.PDE7A在结肠癌组织和结肠癌细胞中表达增加。4.PDE7A的表达增加与结肠癌分化程度呈负相关关系,PDE7A表达和肿瘤大小呈正相关和结肠癌分期呈正相关。5.结肠癌组织中,miR-23b与PDE7A呈负相关。第二部分miR-23b和PDE7A靶向调控关系分析研究目的:探讨在结肠癌细胞系中miR-23b和PDE7A之间的靶向调控关系。研究方法:1.建立过表达miR-23b SW620和SW480结肠癌细胞系。2.利用Western blot分析过表达miR-23b对PDE7AmRNA和蛋白表达的影响。3.双荧光素酶报告验证分析miR-23b和PDE7A靶向关系。结果:1.SW620细胞系中,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b mimics组中miR-23b表达显著增高,具有统计学差异(P0.001)。而在SW480结肠癌细胞中,转染 miR-23b mimics 后,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b mimics 组中miR-23b表达显著增高,具有统计学差异(P0.001)。2.SW620细胞系中,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23bmimics组中,PDE7A mRNA表达水平显著降低,有统计学差异(P0.01)。而在SW480结肠癌细胞中,转染 miR-23b mimics 后,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b mimics组中PDE7AmRNA表达显著降低,具有统计学差异(P0.05)。3.SW620细胞系中,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b mimics组中,PDE7A蛋白表达水平显著降低。而在SW480结肠癌细胞中,转染miR-23b mimics后,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b mimics组中PDE7A蛋白表达显著降低。4.miR-23b能够显著抑制野生型PDE7A荧光活性,而对PDE7A突变型无显著抑制作用。结论:1 PDE7A是miR-23b的靶向基因。2 miR-23b可以负向调控PDE7AmRNA和蛋白的表达,PDE7A是miR-23的下游靶基因。第三部分过表达miR-23b在结肠癌中作用和相关机制研究研究目的:探讨过表达miR-23b在结肠癌中的作用和相关机制。研究方法:1建立过表达miR-23b结肠癌细胞系SW620和SW480细胞中。2 MTT法分析过表达miR-23b对SW620和SW480结肠癌细胞增殖作用。3 Transwell小室分析过表达miR-23b对SW620和SW480结肠癌细胞迁移作用。4 Transwell小室分析过表达miR-23b对SW620和SW480结肠癌细胞侵袭作用。5 Western blot分析过表达miR-23b对SW620和SW480结肠癌细胞EMT的影响。结果:1.SW620细胞系和SW480结肠癌细胞中,miR-23b mimics组中miR-23b表达显著增高后,导致两种结肠癌细胞系的增殖受到抑制,与NC组比较,具有统计学差异(P0.05)。2.SW620细胞系中,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b mimics组中,miR-23b mimics组中miR-23b表达显著增高后,可显著抑制W620和SW480结肠癌细胞迁移,有统计学差异(P0.05;P0.01)。3.SW620细胞系中,与阴性对照组(NCgroup)比较,miR-23bmimics组中,miR-23b mimics组中miR-23b表达显著增高后,可显著抑制SW620和SW480结肠癌细胞侵袭,有统计学差异(P0.05;P0.01)。4.SW620细胞系中,与阴性对照组(NC group)比较,miR-23b组中miR-23b表达显著增高后,EMT相关蛋白E-钙粘蛋白E-cadherin表达增加,而波形蛋白Vimentin表达降低。结论:1过表达miR-23b可抑制结肠癌细胞增殖。2过表达miR-23b可抑制结肠癌细胞侵袭和迁移。3过表达miR-23b可抑制结肠癌细胞EMT,进而抑制结肠癌的进展。第四部分PDE7A敲除在结肠癌中作用和相关机制研究研究目的:分析PDE7A对结肠癌的影响和相关机制。研究方法:1在结肠癌细胞系SW620和SW480细胞中敲除PDE7A。2 MTT法分析PDE7A敲除对SW620和SW480结肠癌细胞增殖作用。3 Transwell小室分析PDE7A敲除对SW620和SW480结肠癌细胞迁移作用。4 Transwell小室分析PDE7A敲除对SW620和SW480结肠癌细胞侵袭作用。5 Western blot分析PDE7A敲除对SW620和SW480结肠癌细胞EMT的影响。结果:1敲除PDE7A后,可显著降低PDE7AmRNA的表达,与NC组比较,具有统计学差异(P0.05)。2敲除PDE7A后,与PDE7A敲除对SW620和SW480结肠癌细胞PDE7AmRNA表达一致,可显著降低PDE7A蛋白的表达。3敲除PDE7A,可抑制PDE7A的表达,结果导致两种细胞系的增殖受到抑制,与NC组比较,具有统计学差异(P0.05)。4 SW620细胞系和SW480结肠癌细胞中,敲除PDE7A,可抑制PDE7A的表达,可显著抑制W620和SW480结肠癌细胞迁移,有统计学差异(P0.05;P0.01)。5 SW620细胞系和SW480结肠癌细胞中,敲除PDE7A,可抑制PDE7A的表达,可显著抑制W620和SW480结肠癌细胞侵袭,有统计学差异(P0.05;P0.01)。6 SW620细胞系和SW480结肠癌细胞中,敲除PDE7A,可抑制PDE7A的表达,EMT相关蛋白E-钙粘蛋白E-cadherin表达增加,而波形蛋白Vimentin表达降低。结论:1敲除PDE7A-1可抑制结肠癌细胞增殖。2敲除PDE7A-1可抑制结肠癌细胞迁移和侵袭。3敲除PDE7A-1可抑制结肠癌细胞EMT,进而抑制结肠癌的进展。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.35
【部分图文】：

电泳图,电泳图,结肠癌组织,样本

学分级（例数）淋巴结转移（例数）逦１０逦转移逦１５逦８逦未转移逦１５逦１２逡逑量检验逡逑泳检测分别提取结肠癌组织样本０和ＳＷ４８０中ｍｉＲＮＡ样本。结果中品，提示无污染后降解（见图１），ｍｉＲＮＡ提取的质量可用于以下实验

结肠癌组织,结肠癌,统计学意义,临床分期

ｍｉＲ－２３ｂ的不同程度的表达，但与癌旁正常组织比较，可见各病理类型结肠癌组逡逑织中ｍｉＲ－２３ｂ表达呈下调趋势，二者之间差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）（见逡逑图２），说明ｍｉＲ－２３ｂ的表达在结肠癌中表达减少。逡逑Ｓ邋－ｉ－ｓ－ｉ逡逑＇Ｅ逡逑１－０－邋Ｉ＇邋Ｉ逡逑｜逦■＂■■■工逡逑Ｋ邋0逦一逡逑３ＭＣ逡逑？逦Ｏ．ｏＪ逦１逦１逦逡逑＜ｕ逡逑ｅｃ逦ＡｄｊａｏＧｒｎ＾逦Ｔｕｍｏｒ逡逑图２邋ｍｉＲ－２３ｂ在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达逡逑注：Ａｄｊａｃｅｎｔ为癌旁正常组织标本，＊＊＊尸＜０．０１逡逑４．邋ｍｉＲ－２３ｂ表达与结肠癌临床分型相关性分析逡逑进一步分析ｍｉＲ－２３ｂ在３０例结肠癌组织和癌旁组织中的表达，判断其是否逡逑与临床分期以及分化程度相关，从表２－２可以看出，ｍｉＲ－２３ｂ的表达减少随着不逡逑同分化的结肠癌而表达不同。在高分化结肠癌组织中，ｍｉＲ－２３ｂ的表达显著减低，逡逑与正常癌旁组织比较具有统计学意义（户＜０．０５），而随着分化程度的降低，逡逑ｍｉＲ－２３ｂ的表达进一步减低。在ＴＮＭ分期中，随着ＴＮＭ分期级别增高，ｍｉＲ－２３ｂ逡逑的表达进一步减少，与正常癌旁组织比较具有统计学意义，差异具有显著统计学逡逑意义（Ｐ＜０．０５；尸＜０．０１）；（见表２－３）。分析ｍｉＲ－２３ｂ表达水平与结肠癌分逡逑化程度和临床分期相关性

结肠癌组织,病理类型,统计学,标本

均可检测到ＰＤＥ７Ａ的表达，但与癌旁正常组织的ＰＤＥ７Ａ表达比较，可见逡逑各病理类型结肠癌组织中ＰＤＥ７Ａ表达呈上升趋势，二者之间差异具有统计学意逡逑义（尸＜０．０１）（见图３）。逡逑泛３１逡逑Ｑ逦＊＊＊逡逑Ｓ逡逑ｉ邋ｎ－逡逑ｏｃ邋Ｏ逦ｉ邋逦逦逦逦邋ｔ逦１逡逑Ａｄｊａｃｅｎｔ邋Ｘｕｍｏｒ逡逑图３邋ＰＤＥ７Ａ邋ｍＲＮＡ在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达逡逑注：Ａｄｊａｃｅｎｔ为癌旁正常组织标本，＊＊＊Ｐ＜０．０１逡逑１７逡逑

【相似文献】