背景肝细胞肝癌作为全世界发生率最高的肿瘤之一,在男性的恶性肿瘤发生率中排名第5位,在女性的恶性肿瘤发生率中排名第7位,死亡率高居世界第3位。大多数肝癌病例(80%)可归因于乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染,这也解释了 HCC的独特地理分布,即大多数病例在发展中国家有地方性感染。而如何提高肝癌的早期诊断率,为患者提高根治性手术的机会是当今肿瘤领域的热点话题。甲胎蛋白是目前临床实践中常用的肿瘤学指标,联合影像学检查用于肝细胞癌的筛查、检测。然而,一些研究表明AFP在早期肝癌诊断中的灵敏度低至22%到60%。因此,我们迫切需要寻找甲胎蛋白以外的有效的非侵入性肿瘤标志物来协助诊断肝癌并指导个体化治疗。DKK3基因是Dickkopf家族的成员,是Wnt信号传导途径的拮抗因子之一,可与Wnt受体复合物竞争性的结合进而选择性抑制Wnt信号传导途径的激活。而拮抗基因表达的沉默会使其自身失去对通路的抑制作用,可导致细胞的无限增殖,肿瘤形成。近年来,研究发现DKK3的下调或沉默与骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞性白血病、AML启动子CpG岛的甲基化有关。而且已有研究表明HCC组织中DKK3的异常启动子甲基化可能是HCC的重要机制。但肝癌组织获取创伤性太大,有局限性。而肝癌患者外周血单个核细胞的获取创伤性小,且尚未见报道肝癌外周血单个核细胞中DKK3的甲基化状态。ITIH5是ITI家族的一员,通过与透明质酸的共价结合来维持ECM,即细胞外基质的稳定。目前已有较多研究表明,ITIH5在乳房癌、结肠癌、肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤中异常甲基化状态,可引起基因表达下调。而在肿瘤的形成过程中,ITIH5基因表达下调或沉默与肿瘤的转移及恶性进展有关。但目前肝癌患者中ITIH5启动子、第一外显子的甲基化状态及其潜在的作用仍是未知的。因此本研究的目的是研究肝癌外周血单个核细胞中DKK3启动子、ITIH5启动子、第一外显子的甲基化状态,以及其潜在诊断价值。研究方法在这项研究中,招募了 203名受试者,其中包括113名肝癌患者,60名慢性乙型肝炎患者和30名正常对照者。通过手工法提取外周血单个核细胞中的DNA、RNA,RNA逆转录为cDNA,运用MSP,即甲基化特异性聚合酶链反应检测HCC组、CHB组和HC组外周血单个核细胞中DKK3、ITIH5的甲基化状态。RT-qPCR,即实时荧光定量PCR来检测HCC组、CHB组和HC组外周血单个核细胞中DKK3、ITIH5 的 mRNA 水平。结果1.HCC组外周血单个核细胞DKK3启动子甲基化率(73.45%,83/113)要明显高于 CHB 组(38.33,23/60,P=0.000)和正常对照组(36.67,11/30,P=0.000)。CHB组与正常对照组之间的甲基化率无统计学差异(P=0.878)。HCC组外周血单个核细胞中ITIH5启动子和第一外显子甲基化率为75.22%(85/113),明显高于 CHB 组(33.33,20/60,P=0.000)和正常对照组(30.00,9/30,P=0.000)。CHB组、正常对照组之间的甲基化率无统计学差异(P=0.750)。2.HCC患者组外周血单个核细胞中DKK3 mRNA水平明显低于CHB患者组(P=0.0020)和正常对照组(P0.0001)。CHB患者组外周血单个核细胞中DKK3 mRNA水平显著低于正常对照组(P=0.0011)。HCC患者组外周血单个核细胞中ITIH5 mRNA水平明显低于慢乙肝患者组(P0.0001)和正常对照组(P0.0001)。CHB患者组外周血单个核细胞ITIH5 mRNA水平显著低于正常对照(P=0.0003)。HCC患者组中DKK3、ITIH5阳性组mRNA水平分别低于DKK3阴性组(P=0.0005)、ITIH5 阴性组(P=0.0110)。3.肿瘤大小3cm的HCC患者外周血单个核细胞中DKK3甲基化率要明显高于肿瘤大小≤3cm的HCC患者(X2=5.399,P=0.020),且肿瘤大小3cm的HCC患者外周血单个核细胞中DKK3 mRNA水平明显低于肿瘤大小≤3cm的HCC患者组(P=0.0132)。HCC组外周血单个核细胞中ITIH5启动子、第一外显子的甲基化率与血管侵袭(X2=6.240,P=0.012)、TNM 分期(X2=5.034,P=0.025)相关。且ITIH5 mRNA水平与血管侵袭(P=0.0090)、TNM分期(P=0.0203)有关。4.外周血单个核细胞中DKK3基因甲基化诊断HCC的敏感性为73.45%,ITIH5基因甲基化诊断HCC的敏感性为75.22%。DKK3甲基化、ITIH5甲基化联合在诊断早期肝癌方面的敏感性为86.49%,明显高于血清AFP(86.49%vs54.05%,P=0.002)。结论研究表明,外周血单个核细胞中DKK3、ITIH5的甲基化可能参与肝癌的发生发展。DKK3甲基化、ITIH5甲基化联合检测在肝癌诊断中的应用明显提高了肝癌早期诊断的敏感性,可能成为检测早期肝癌和肝癌转移的有效非侵入性肿瘤标志物。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
?（ＴＩＭＳ??图２外周血单个核细胞ＤＫＫ３、ＩＴＩＨ５甲基化率在ＨＣＣ组、ＣＨＢ组、ＨＣ组比较??图２?ａ?ＤＫＫ３启动子在ＨＣＣ组、ＣＨＢ组、丨Ｋ：组的甲基化状态??ｂ?ＩＴＩＨ５启动子、第一外显子在ＨＣＣ组、ＣＨＢ组、ＨＣ组的甲基化状态。??ＨＣＣ，肝细胞癌；ＣＨＢ，慢性乙型病毒性肝炎；ＨＣ，健康对照。??３３??
图３?ＤＫＫ３、ＩＴＩＨ５甲基化特异性聚合酶链反应产物凝胶图??ａ?ＤＫＫ３甲基化特异性聚合酶链反应产物凝胶图??ｂ?ＩＴ１Ｈ５甲基化特异性聚合酶链反应产物凝胶图??Ｍ，甲基化产物条带；Ｕ，非甲基化产物条带；ＨＣＣ，肝细胞癌；ＣＨＢ，慢性乙型病毒性肝炎；??ＨＣ，健康对照；ＷＢ，空白对照。??３４??
图５外周血单个核细胞中ＤＫＫ３、ＩＴＩＨ５的甲基化状态与定量因素之间相关性的研究??ａ?ＤＫＫ３的甲基化状态与ＡＬＴ水平无相关性（Ｐ?＝?０．?４６４４）．?ｂ?ｃ?ＤＫＫ３的甲基化状态与ＡＳＴ?（Ｐ??＝０？?４１４５）、ＡＬＢ?（Ｐ?＝?０？?９５０７）均无相关性．ｄ?ｅ?ＴＢＩＬ（Ｐ?＝?０？?１９２４）水平、ＰＴＡ?（Ｐ?＝?０？?９１４５）??在ＤＫＫ３甲基化组与非甲基化组之间未探索到相关性．ｆ?ＡＦＰ水平（（ｌｏｇ?１０?ｎｇ?ｐｅｒ?ｍＬ）??在ＤＫＫ３甲基化组与非甲基化组之间无统计学意义（Ｐ?＝?０．?８７３３）．?ｇ－１?ＡＬＴ水平（Ｐ＝０．?９５７９），??ＡＳＴ?水平?Ｔ（Ｐ＝０．?５５６９），?ＡＬＢ?水平（Ｐ＝０．?０９６１），?ＴＢＩＬ?水平（Ｐ＝０．?５１０６），?ＰＴＡ（Ｐ＝０．?４７７２）?ａｎｄ?ＡＦＰ??水平（ｌｏｇ?１０?ｎｇ?ｐｅｒ?ｍＬ，Ｐ＝０．?１８９０）在ＩＴＩＨＳ甲基化组、非甲基化组之间无统计学意义．??ＡＬＴ，谷丙转氨酶；ＡＳＴ，谷草转氨酶；ＡＬＢ，血清白蛋白；ＴＢＩＬ，总胆红素；ＰＴＡ，凝血酶原??活动度；ＡＦＰ，甲胎蛋白。??
【参考文献】
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2836197
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