BCA3在肝细胞癌中的表达、生物学功能及分子机制研究

发布时间：2020-10-11 17:34

　　 原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率分别居所有恶性肿瘤的第六位和第二位,严重威胁人类健康。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的病理类型,约占病例总数的70%。外科手术是治疗HCC的最有效措施,但是,由于HCC患者初期症状不典型,多数患者在检出时已经处于疾病进展期,错过最佳的手术时机。对于进展期肝癌患者,传统的放疗、化疗等治疗措施效果非常有限,而且副作用较大,对于HCC患者的生活质量、生存期提升并不显著。因此,探寻新的早期诊断、预后评估和靶向治疗措施是HCC患者在临床诊治中面临的关键问题。肝癌的发生发展涉及诸多肿瘤相关癌基因和抑癌基因的变异,其分子机制至今尚未完全阐明。乳腺癌相关基因3(Breast Cancer-Associated Gene 3,BCA3)最初是从乳腺癌细胞和配对正常细胞的消减杂交文库中鉴定而来。BCA3可以与PKA相互作用,故而又被称为PKA相互作用蛋白(A-kinase-interacting protein 1,AKIP1)。BCA3基因位于11号染色体短臂。研究报道,BCA3在乳腺癌、食管癌等恶性肿瘤的进程中扮演癌基因的角色。在乳腺癌、食管癌的临床样本中,BCA3在癌组织中的表达显著高于对应癌旁组织。在细胞生物学层面,BCA3可增强癌细胞的增殖、转移、侵袭以及肿瘤血管新生能力。BCA3可与Rac-1相互作用,共同介导肌动蛋白细胞骨架的重塑,亦可与TAp73相互作用,促进bax蛋白依赖的终末凋亡途径caspase-7和caspase-9的激活。此外,另一个报道较多的机制为BCA3通过与蛋白激酶A(protein kinase A)相互作用,共同促进NF-κB的细胞核转位,激活NF-κB信号通路,增强其转录效应。BCA3在多种恶性肿瘤中的作用提示其可能为一个功能重要的癌基因,然而,BCA3在肝癌中的表达及生物学功能尚缺乏系统的研究。因此,本研究旨在探讨BCA3在肝癌中的表达、对肝癌细胞生物学功能的影响及分子机制,以期为肝癌的靶向治疗提供理论指导。第一部分 BCA3在肝细胞癌中的表达及临床意义目的探索 BCA3在临床肝细胞癌组织和配对癌旁肝组织、肝癌细胞系和正常肝脏细胞系中的表达及临床意义。方法1.收集107对肝细胞癌患者癌组织标本及配对癌旁肝脏组织标本;选用肝癌细胞系及正常肝脏细胞系。2.采用实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)技术检测BCA3在临床肝癌组织和配对癌旁肝脏组织中、肝癌细胞系和正常肝细胞中mRNA水平的表达。3.采用免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry)检测BCA3在肝细胞癌组织和配对癌旁肝脏组织中蛋白水平的表达。采用免疫印迹法(Western Blot)检测肝癌细胞系和正常肝脏细胞中BCA3蛋白水平的表达。4.统计分析BCA3在肝癌组织中的表达与肝癌患者年龄、性别、TNM分期等临床病理特点之间的关系。结果1.BCA3在肝癌各个细胞系中的表达均高于正常永生化的肝脏细胞Chang Liver和HL7702。此外,BCA3在高侵袭性的肝癌细胞系中的表达高于低侵袭性的肝癌细胞系。2.BCA3在肝癌组织中的表达显著高于癌旁肝脏组织,差异具有统计学意义(mRNA 水平:p=0.000;蛋白水平:p=0.001)。3.BCA3在肝癌组织中的表达与肝癌患者的肿瘤大小(p=0.003)、微血管侵犯(p=0.020)和 TNM 分期(p=0.034)正相关。结论1.BCA3在肝癌细胞系中的表达高于正常肝脏细胞,在肝癌组织中的表达高于癌旁肝脏组织。2.BCA3在肝癌组织中的表达与肿瘤大小、微血管侵犯、TNM分期正相关。第二部分BCA3对肝癌细胞恶性生物学行为的调控作用研究目的通过体内和体外实验检测BCA3对肝癌细胞恶性生物学功能(增殖、克隆、侵袭、迁移、促血管新生等能力)的影响。方法1.借助短发夹RNA(shRNA)干扰技术,将两个沉默BCA3的shRNA序列转染MHCC97H细胞以沉默BCA3表达,无效干扰序列转染细胞作为对照,使用嘌呤霉素筛选稳定敲低BCA3的细胞株和对照细胞株;定制BCA3真核表达载体pCMV-BCA3转染HepG2细胞,空载质粒转染细胞作为对照。采用Western Blot技术检测BCA3的沉默效率和过表达效率。2.将培养的MHCC97H细胞分为三组,对照组(MHCC97H/shcontrol)、沉默BCA3组(两个干扰序列分别对应MHCC97H/shBCA3#1和MHCC97H/shBCA3#2),采用CCK-8法检测三组细胞增殖能力的差异;将培养的HepG2细胞分为两组,对照组(HepG2/vector)和过表达BCA3组(HepG2/BCA3),采用CCK-8法检测两组细胞增殖能力的差异;采用平板克隆形成法检测各组细胞克隆形成能力的差异。3.采用普通transwell/预铺胶的transwell技术分别检测MHCC97H/shcontrol、MHCC97H/shBCA3#1 和 MHCC97H/shBCA3#2 的迁移/侵袭能力差异,以及HepG2/vector和HepG2/BCA3细胞迁移/侵袭能力的差异。4.分别收集 MHCC97H/shcontrol、MHCC97H/shBCA3#1 和 MHCC97H/shBCA3#2细胞,以及HepG2/vector和HepG2/BCA3细胞的上清,与人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)混合,分别采用transwell技术和体外小管形成技术检测沉默/过表达BCA3后各组细胞上清对HUVECs迁移和体外血管新生能力的影响。5.将MHCC97H/shcontrol和MHCC97H/shBCA3#2细胞分别注射入裸鼠皮下和经尾静脉注射入裸鼠体内,检测BCA3对肝癌细胞在裸鼠体内增殖、转移能力的影响。结果1.相较于对照组 MHCC97H/shcontrol 细胞,MHCC97H/shBCA3#1 和MHCC97H/shBCA3#2细胞均出现显著的BCA3表达下调;相较于HepG2/vector细胞,HepG2/BCA3细胞出现显著的BCA3表达上调。2.MHCC97H/shBCA3#1(增殖:p=0.005;克隆形成:p=0.001)和MHCC97H/shBCA3#2(增殖:p=0.002;克隆形成:p=0.001)组细胞的增殖能力、克隆形成能力显著弱于MHCC97H/shcontrol细胞;而HepG2/BCA3细胞增殖能力、克隆形成能力显著强于HepG2/vector细胞(增殖:p=0.008;克隆形成:p=0.000)。3.MHCC97H/shBCA3#1(迁移:p=0.001;侵袭:p=0.000)和 MHCC97H/shBCA3#2(迁移:p=0.001;侵袭:p=0.000)组细胞的迁移、侵袭能力显著弱于MHCC97H/shcontrol细胞;而HepG2/BCA3细胞的迁移、侵袭能力显著强于HepG2/vector 细胞(迁移:p=0.001;侵袭:p=0.002)。4.MHCC97H/shBCA3#1(小管数量:p=0.010;小管长度:p=0.004;小管交叉数目:p=0.024)和MHCC97H/shBCA3#2(小管数量:p=0.002;小管长度:p=0.001;小管交叉数目:p=0.005)组细胞的上清可以显著抑制HUVECs的小管形成能力;HepG2/BCA3细胞的上清可以显著增强HUVECs的小管形成能力(小管数量:p=0.004;小管长度:p=0.013;小管交叉数目:p=0.003)。5.沉默BCA3可以显著抑制MHCC97H细胞的裸鼠体内增殖(p=0.001)和转移能力(2/10 vs 7/10)。结论1.BCA3可以增强肝癌细胞体外增殖、克隆、迁移、侵袭和促血管新生能力。2.沉默BCA3可以抑制肝癌细胞在裸鼠体内的增殖和转移能力。第三部分BCA3通过AKT信号通路调控肝癌细胞的恶性生物学行为目的探讨BCA3促进肝癌细胞增殖、克隆、侵袭、迁移和促血管新生能力的分子生物学机制。方法1.采用Western Blot技术检测沉默/过表达BCA3对AKT信号通路关键蛋白及其磷酸化蛋白表达水平的影响。2.采用免疫荧光技术检测沉默/过表达BCA3对NF-κB p65亚基细胞质-细胞核转位的影响。3.检测临床肝癌样本中BCA3与磷酸化的AKT(p-AKT)表达之间的相关性。4.采用抑制剂LY294002阻断AKT信号通路,检测BCA3引起的生物学功能是否受到抑制。LY294002处理MHCC97H细胞,实验分空白组MHCC97H/blank、对照组 MHCC97H/DMSO 和实验组 MHCC97H/LY294002 三组;LY294002处理HepG2/BCA3细胞,实验分空白组BCA3/mock、对照组BCA3/DMSO和实验组BCA3/LY294002三组。分别检测各组的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和促HUVECs小管形成能力。结果1.沉默 BCA3 可以显著下调 p-AKT、p-NF-κB p65、p-mTOR、p-4EBP1 和p-p70s6k 的表达;过表达 BCA3 可以显著上调 p-AKT、p-NF-κBp65、p-mTOR、p-4EBP1 和 p-p70s6k 的表达。2.沉默BCA3促进NF-κB p65的细胞核-细胞质转位;过表达BCA3促进NF-κB p65的细胞质-细胞核转位。3.临床样本中,BCA3与p-AKT表达呈显著正相关(r=0.549,p=0.000)。4.MHCC97H/LY294002组细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和促血管形成能力均显著弱于MHCC97H/DMSO(增殖:p=0.003;克隆形成:p=0.000;迁移:p=0.000;侵袭:p=0.001;小管数量:p=0.001;小管长度:p=0.0014;小管交叉数目:p=0.010)和 MHCC97H/blank(增殖:p=0.002;克隆形成:p=0.000;迁移:p=0.001;侵袭:p=0.000;小管数量:p=0.001;小管长度:p=0.007;小管交叉数目:p=0.017)组细胞。BCA3/LY294002组细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移、侵袭能力均显著弱于BCA3/mock(增殖:p=0.001;克隆形成:p=0.000;迁移:p=0.000;侵袭:p=0.001;小管数量:p=0.001;小管长度:p=0.001;小管交叉数目:p=0.005)和 BCA3/DMSO(增殖:p=0.002;克隆形成:p=0.000;迁移:p=0.001;侵袭:p=0.000;小管数量:p=0.002;小管长度:p=0.002;小管交叉数目:p=0.010)组细胞。结论BCA3通过正向调控AKT信号通路,激活mTOR信号途径,促进NF-κB p65细胞质-细胞核转位,调控肝癌细胞的生物学功能。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

ＨＣＣＬＭ３、ＭＨＣＣ９７Ｈ、ＭＨＣＣ９７Ｌ、ＳＭＭＣ－７７２１、ＨｅｐＧ２?和?Ｈｕｈ－７?的?ｍＲＮＡ??和蛋白。米用定量ＰＣＲ法检测ＢＣＡ３?ｍＲＮＡ在各细胞系中的表达。米用Ｗｅｓｔｅｒｎ??Ｂｌｏｔ技术检测ＢＣＡ３蛋白在各细胞系中的表达。结果如图１．２?Ａ和图１．２?Ｂ所示，??与Ｃｈａｎｇ?ｌｉｖｅｒ、ＨＬ７７０２细胞系相比，各个肝癌细胞系中ＢＣＡ３在ｍＲＮＡ水平的??表达和蛋白水平的表达均显著上调。此外，ＢＣＡ３在高侵袭性肝癌细胞系??ＨＣＣＬＭ３、ＭＨＣＣ９７Ｈ中的表达显著高于低侵袭性肝癌细胞系ＭＨＣＣ９７Ｌ、??ＳＭＭＣ－７７２１、ＨｅｐＧ２和Ｈｕｈ－７。根据各个细胞系中ＢＣＡ３的表达，拟选取ＢＣＡ３??表达较高的ＭＨＣＣ９７Ｈ细胞进行ＢＣＡ３的反向消减实验（后文简称敲低），选取??ＢＣＡ３表达较低的ＨｅｐＧ２细胞进行正向过表达实验（后文简称过表达）。??１９??

含量之间的关系。我们对包含１０７对肝细胞癌组织和癌旁组织的芯片进行免疫??组化染色及评分。免疫组化染色结果显示：ＢＣＡ３主要表达于细胞核内，癌旁组??织和ＢＣＡ３不同表达程度的肝癌组织染色结果如图１．３?Ａ所示。经统计，ＢＣＡ３??在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织（图１．３?Ｂ，ｐ＜０．００１）。进一步的分析结果??显示，在１０７例肝癌组织中，４２例患者呈ＢＣＡ３低表达，６５例患者呈ＢＣＡ３高??表达，ＢＣＡ３高表达与患者肿瘤大小（ｐ＝０．００３）、微血管侵犯（ｐ＝０．０２０）以及ＴＮＭ??分期（ｐ＝〇．０３４）呈正相关。具体见表１。??八?Ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ??Ｔｕｍｏｒ??ｑ??ＢＣＡ３?（ｌｏｗ）?ＢＣＡ３?（ｈｉｇｈ）??閉１哪調?Ｉｆ??ｉ。丨亨申??图１．３?Ａ?ＢＣＡ３在肝癌组织和癌旁组织中代表性免疫组化染色结果。Ｂ肝癌组织和癌旁组织??中，ＢＣＡ３的免疫组化评分结果。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ａ?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｐｉｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ?ＩＨＣ?ａｇａｉｎｓｔ?ＢＣＡ３?ｉｎ?ＨＣＣ?ｔｉｓｓｕｅ??（ｔｕｍｏｒ）?ａｎｄ?ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ．?Ｂ?ＩＨＣ?ｓｃｏｒｅｓ?ｏｆ?ＢＣＡ３?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ａｎｄ?ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ．??２０??

?；４椰辦?????图１．２定量ＰＣＲ技术（Ａ）和Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ技术（Ｂ）分别检测ＢＣＡ３在各个肝癌细胞株以及??正常永生化的肝脏细胞Ｃｈａｎｇ?ｌｉｖｅｒ和ＨＬ７７０２中的表达。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｔｈｅ?ｍＲＮＡ?ａｎｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｌｅｖｅｌｓ?ｏｆ?ＢＣＡ３?ｉｎ?ａ?ｃｏｕｐｌｅ?ｏｆ?ＨＣＣ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｎｏｒｍａｌ??ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?Ｃｈａｎｇ?ｌｉｖｅｒ?ａｎｄ?ＨＬ７７０２．??２．３?ＢＣＡ３在肝细胞癌组织中表达的临床意义??为了进一步明确ＢＣＡ３在肝细胞癌组织和癌旁组织中在蛋白水平的表达是??否有差异，以及ＢＣＡ３在肝细胞癌组织中的表达与患者发病年龄、性别、乙肝??病毒感染与否、Ｃｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈ分级、肿瘤数目、肿瘤大小、ＴＮＭ分期以及血清ＡＦＰ??含量之间的关系。我们对包含１０７对肝细胞癌组织和癌旁组织的芯片进行免疫??组化染色及评分。免疫组化染色结果显示：ＢＣＡ３主要表达于细胞核内，癌旁组??织和ＢＣＡ３不同表达程度的肝癌组织染色结果如图１．３?Ａ所示。经统计，ＢＣＡ３??在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织（图１．３?Ｂ，ｐ＜０．００１）。进一步的分析结果??显示，在１０７例肝癌组织中，４２例患者呈ＢＣＡ３低表达，６５例患者呈ＢＣＡ３高??表达
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本文编号：2836899