溶瘤病毒oHSV-1宿主限制因子筛选及初步验证

发布时间：2020-10-13 03:29

　　 癌症是世界范围内的主要公共健康问题。近年来随着肿瘤新药、药物伴随诊断和多种新型疗法的开发,肿瘤治疗取得了一系列突破性的进展,过去十年间主要发达国家的癌症死亡率在稳步下降。溶瘤病毒疗法作为一种新型的肿瘤免疫治疗手段,已经成为未来最具有潜力和应用前景的恶性肿瘤新型治疗手段之一。近年来已开展的溶瘤病毒相关临床试验超过60个,美国Amgen公司的溶瘤病毒T-VEC于2015年获批上市销售,成为首个美国FDA批准的用于晚期肿瘤治疗的病毒疗法。尽管溶瘤病毒在临床试验中展示出良好的安全性和抗肿瘤活性,但由于肿瘤的复杂性导致溶瘤病毒疗法对不同类型肿瘤以及对同一类型肿瘤的不同患者之间的治疗效果存在较大差异。这种临床应答差异促使我们对溶瘤病毒选择性杀伤机制进行研究以期鉴别在其中发挥关键作用的宿主限制因子,从而有助于指导溶瘤病毒未来的临床应用,或是开发新的治疗药物解除宿主因子的限制从而进一步增强溶瘤病毒疗效。通过对实验室前期构建的溶瘤病毒oHSV-1进行溶瘤研究发现,病毒敏感型HeLa细胞中存在少量能够抵抗oHSV-1杀伤的细胞,通过病毒反复感染剩余细胞的方式将这部分病毒抵抗型细胞富集,命名为HeLa-R细胞。为探究HeLa-R细胞抵抗溶瘤病毒杀伤的分子机制,首先我们利用转录组测序RNA-Seq技术对HeLa和HeLa-R细胞的基因表达水平进行比较,筛选出差异表达基因共448个,其中HeLa-R细胞中上调表达基因197个,下调表达基因251个。接着我们进一步对448个基因进行GO功能注释及KEGG富集分析,发现差异基因GO功能注释主要富集在生物进程和细胞组分方面。KEGG富集分析显示富集最显著的是细胞外基质受体相互作用,此外细胞基质粘连、癌症相关信号通路等多个生物学进程均被富集。随后我们分别从HeLa-R显著上调基因和富集信号通路两个方面对RNA-Seq结果进行分析验证。我们利用RNA干扰技术沉默HeLa-R细胞中22个显著上调基因,通过显微观察、结晶紫染色和WST-1细胞活力检测法分析是否下调这些基因的表达会促进oHSV-1对HeLa-R细胞的杀伤能力。经过多次验证我们发现CREB3L1,CXCL1和OLR1三个基因在HeLa-R细胞抵抗溶瘤病毒杀伤中起重要作用,其中CXCL1在多株病毒抵抗型细胞中均高表达且下调其表达后溶瘤病毒对它们的杀伤能力增强。此外,我们针对部分KEGG富集信号通路中关键信号分子选择对应的抑制剂来验证相关信号通路是否在HeLa-R细胞抵抗oHSV-1杀伤中发挥作用,研究结果表明MEK1/2抑制剂U0126(MAPK信号通路)及CDK4/6抑制剂Palbociclib(Cell cycle信号通路)能够提高溶瘤病毒oHSV-1对HeLa-R细胞的杀伤作用。本研究利用RNA-Seq技术筛选宿主细胞中限制溶瘤病毒复制杀伤的因子,发现CREB3L1,CXCL1和OLR1三个在病毒抵抗型细胞中发挥抗病毒作用的基因,并对其抗病毒机制进行了初步研究,研究结果将为溶瘤病毒oHSV-1临床治疗提供伴药诊断指导,为提高病毒溶瘤活性提供了潜在的分子靶标。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.5
【部分图文】：

毒类型??中存在将近１００万的脊椎动物病毒，其中约有３２万能够感染然而并不是所有病毒都适用于肿瘤治疗。表１－１对多种可作为毒及其特点进行了总结。??表１－ｌａ?ＤＮＡ病毒特性［６］??Ｔａｂｌｅ?１－ｌａ?Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ?ｏｆ?ｓｅｌｅｃｔ?ＤＮＡ?ｖｉｒｕｓｅｓ１６１??Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ?Ｖａｃｃｉｎｉａ?ｖｉｒｕｓ?Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ?Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ?Ｈｉ??来｜＃??Ｉ?ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１?Ｉ?Ｉ??７０－９０?ｎｍ?７０－１００?ｎｍ?２００?ｎｍ?１８－２８?ｎｍ??ｌｔｉｍｏｒｅ?ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｃｒｏｕｐ?ｌ：ｄｓＤＮＡ?Ｃｒｏｕｐ?Ｉ：?ｄｓＤＮＡ?Ｃｒｏｕｐ?Ｉ：?ｄｓＤＮＡ?Ｃｒｏｕｐ?ＩＩ：?ｓｓＤＮＡ??ｍｉｌｙＡｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ?Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ?Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ?Ｐａｒｖｏｖｉｒｌｄａｅ??

图.即.呐归晰.峭面

通过提高病毒感染复数（ＭＯＩ）以期１００％杀伤肿瘤细胞，以ＭＯＩ＝５的病毒??剂量感染三种肿瘤细胞系：Ｈ１２９９、ＭＣＦ７及ＨｅＬａ，显微镜观察并记录感染后第??０天、２天、５天及１５天后溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤情况（图３－２）。结果显??示病毒处理后第２天，三种肿瘤细胞均仅残余少于１％的肿瘤细胞；病毒处理后??第５天，ＨｅＬａ细胞可观察到未被杀死的少量肿瘤细胞开始增殖，而Ｈ１２９９和??ＭＣＦ７细胞在病毒处理后残余的少量细胞未发生增殖；病毒处理后第１５天，ＨｅＬａ??细胞汇合度由第５天的约５％以下增长至约７０％，而Ｈ１２９９和ＭＣＦ７无细胞存??活。由此推测，ＨｅＬａ细胞中可能存在少数能够抵抗溶瘤病毒杀伤的细胞亚型。??０?ｄａｙ?２?ｄａｙ?５?ｄａｙ?１５?ｄａｙ??Ｈ?■■■■??＿Ｅ?…??■■■■??图３－２肿瘤细胞感染ｏＨＳＶ－ｌ后生长情况观察??Ｆｉｇ．３－２?Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌｓ?ａｆｔｅｒ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ?ｗｉｔｈ?ｏＨＳＶ－１??３２??
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 ;Anti-tumor effect of oncolytic herpes simplex virus G47delta on human nasopharyngeal carcinoma[J];癌症;2011年12期

2 夏忠军,常建华,张力,姜文奇,管忠震,刘基巍,张阳,胡晓桦,吴国华,王华庆,陈正常,陈建超,周清华,陆建伟,樊青霞,黄建瑾,郑晓;基因工程腺病毒(H101)瘤内注射联合化疗治疗头颈部及食管鳞癌的Ⅲ期临床研究[J];癌症;2004年12期

本文编号：2838672