cIAP2在胆囊癌生长转移中的作用及其调控机制

发布时间：2020-10-14 09:21

　　 【研究背景】胆囊癌的发生发展机制至今仍不明确。抑制凋亡是肿瘤细胞生存的关键因素,可使肿瘤在恶劣的微环境中生长和转移。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一类高度保守的蛋白,因抑制细胞凋亡而得名,与肿瘤发生发展密切相关。目前IAPs家族中研究最多的是Survivin,该家族另一重要成员c IAP2与肿瘤的关系研究甚少,与胆囊癌的关系更是未见相关报道。已知TNF-a与其受体结合后可募集RIP1、c IAP2等蛋白形成信号“复合体I”,通过该复合体启动TNF-a致细胞生存或凋亡通路,RIP1泛素化是启动细胞生存通路的重要因素。c IAP2作为“复合体I”成员,具有泛素酶活性,推测c IAP2通过泛素化修饰RIP1使TNF-a启动了细胞生存通路,从而促进胆囊癌的发生发展。因此本课题拟探讨c IAP2在胆囊癌生长转移中的作用及其调控机制,研究结果有助于揭示胆囊癌发展机制。【方法】1、荧光PCR和免疫组化检测临床胆囊癌组织(GBC)c IAP2表达,并分析其与临床病理参数及预后的关系。2、在GBC细胞NOZ中沉默或过表达c IAP2,应用CCK8、划痕实验、Trsanwell小室、与HDLEC共培养实验检测c IAP2对NOZ细胞恶性生物学行为的影响。3、构建裸鼠原位GBC,观察c IAP2对裸鼠GBC生长及转移的影响。4、双荧光素酶报告基因、蛋白免疫印迹、免疫荧光及ELISA方法探索c IAP2与TNF-a-NF-κB(P65)和TNF-a-VEGF-C相关性。免疫共沉淀和免疫荧光定位验证c IAP2与RIP1间的相互作用,并通过泛素突变体探索c IAP2靶向修饰RIP1的方式。【结果】1.GBC组织中c IAP2表达与患者淋巴转移和预后的关系c IAP2 m RNA和蛋白在GBC组织中的表达量显著高于癌旁组织(m RNA:6.54±0.88 Vs 3.25±0.39,P0.05;蛋白:0.2854±0.0061 Vs 0.1722±0.0084,P0.05)。临床病理参数分析:c IAP2的表达与患者淋巴结转移正相关(X 2=13.227,P0.001);c IAP2高表达患者中位生存时间(18个月)显著低于低表达者(34个月);c IAP2高表达患者2年总体生存率(16.7%)显著低于低表达者(64.3%),P0.05。2、c IAP2对胆囊癌NOZ细胞的恶性生物学行为及淋巴管生成的影响成功构建两组c IAP2干扰细胞NOZ,分别为sic IAP2#1和sic IAP2#2,以及c IAP2高表达NOZ细胞。CCK8检测:第60h检测时,干扰c IAP2表达后sic IAP2#1组(0.840±0.028)和sic IAP2#2组(0.773±0.015)NOZ细胞的增殖能力较对照组(1.118±0.058)显著下降;过表达c IAP2组(1.314±0.005)的NOZ细胞增殖能力显著高于空载体组(1.001±0.002)。划痕实验:第24h检测时,干扰c IAP2表达后sic IAP2#1组(38.67±1.20%)和sic IAP2#2组(40.00±2.08%)NOZ细胞的迁移能力较对照组(56.67±2.40%)显著下降;过表达c IAP2组(84.67±2.60%)的NOZ细胞迁移能力显著高于空载体组(55.0±2.08%)。Transwell小室:干扰c IAP2表达后sic IAP2#1组(148±8.32)和sic IAP2#2组(154.7±8.37)NOZ细胞的侵袭能力显著低于对照组(290.3±11.83);过表达c IAP2组(376.3±7.84)的细胞侵袭能力相对空载体组(257.3±9.26)显著升高。胆囊癌NOZ细胞与HDLEC共培养:干扰c IAP2表达后sic IAP2#1组(11.0±0.58)和sic IAP2#2组(11.33±1.86)细胞的淋巴成管能力较对照组(18.67±1.76)明显下降;过表达c IAP2组(27.33±0.88)的细胞淋巴成管能力相对空载体组(17.67±1.45)显著升高。3、c IAP2对裸鼠GBC的形成、腹腔淋巴结转移和微淋巴管形成的影响接种干扰c IAP2组细胞(sic IAP2#1)与对照组比较,裸鼠GBC平均重量降低(1.074±0.160g Vs 1.701±0.228g,P=0.0405)、腹腔转移淋巴结的平均数量减少(2.250±1.11 Vs 7.125±1.977,P=0.0497)、GBC淋巴管密度降低(5.625±1.668 Vs11.88±2.781,P=0.0436);接种过表达c IAP2组与空载对照组细胞比较,裸鼠的GBC平均重量增加(2.544±0.298g Vs 1.689±0.239g,P=0.0421)、裸鼠腹腔转移淋巴结平均数量增加(18.750±4.843 Vs7.000+1.982,P=0.0414)、GBC淋巴管密度增高(17.75±1.509 Vs 11.50±2.22,P=0.0354)。4、c IAP2对TNF-a诱导的NF-κB和VEGF-C活性的影响,以及对RIP1的泛素化修饰双荧光素酶报告系统检测TNF-a刺激不同组NOZ细胞后NF-κB(P65)的活性,结果显示c IAP2干扰组:sic IAP2#1组(0.553±0.069)和sic IAP2#2组(0.637±0.067))的NF-κB(P65)的活性显著低于干扰对照组(1.157±0.069);c IAP2过表达组(1.413±0.147)的NF-κB(P65)的活性显著高于对照空载组(0.930±0.073)。Westren blot和细胞免疫荧光检测NF-κB核转移情况,干扰c IAP2表达后,TNF-a刺激引起NOZ细胞NF-κB核转移减少;过表达c IAP2,TNF-a刺激引起NOZ细胞NF-κB核转移增加。ELISA检测c IAP2对VEGF-C活性的影响,c IAP2干扰组:sic IAP2#1组(44.67±3.71)和sic IAP2#2组(52.67±3.93)的VEGF-C的活性显著低于干扰对照组(95.33±4.91);c IAP2过表达组(148.0±6.81)的VEGF-C的活性显著高于对照空载组(84.67±4.81)。免疫共沉淀和荧光共定位实验结果显示在NOZ细胞内c IAP2可结合RIP1,并通过K63位点对RIP1进行多聚泛素化修饰。【结论】1、c IAP2在人GBC组织中表达增高,并与患者的淋巴结转移和预后相关。2、c IAP2可促进GBC细胞增殖、侵袭和淋巴管形成,从而促进GBC生长、微淋巴管生成和淋巴结转移。3、c IAP2可增强TNF-a诱导的NF-κB(P65)和VEGF-C表达。4、c IAP2可与RIP1结合,并通过K63位点对RIP1进行多聚泛素化修饰。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.8
【部分图文】：

图 1-1 qRT-PCR 检测胆囊癌及癌旁组织 cIAP2 mRNA 的表达情况（胆囊癌组织/癌旁胆囊组织,-ΔΔCt 值）表 1-1 胆囊癌组织、癌旁组织 cIAP2 mRNA 的表达情况分组 例数 cIAP2 mRNA（2-△CT） 2-△△CTp胆囊癌组织 44 6.54±0.88 2.43 0.000旁胆囊组织 44 3.25±0.392、免疫组化检测 cIAP2 蛋白在人的胆囊癌组织中的表达免疫组化检测 cIAP2 蛋白在胆囊癌组织及相对应的癌旁胆囊组织表达，结果显示 cIAP2 蛋白在胆囊癌组织中表达高于正常胆囊组织（图 1-2）。统计分析结果显示胆囊癌组织中 MOD=0.2854±0.0061，癌旁胆囊组织中 MOD=0.1722±0.0084，两者差异有显著性，P<0.05。

18图 1-2 免疫组化检测 cIAP2 蛋白在胆囊癌组织中的表达（A）胆囊癌组织；（B）正常胆囊组织cIAP2 mRNA 与胆囊癌患者临床病理参数之间的关系通过比较胆囊癌组织中 cIAP2 mRNA 表达情况与影响胆囊癌发生发展的几要临床病理因素（性别，年龄，肿瘤部位，肿瘤大小，病理类型，分化程

P2 与胆囊癌患者预后的关系P2 mRNA 低表达的胆囊癌患者中位生存时间为 34 个月，cIAP2 胆囊癌患者中位生存时间为 18 个月，两者比较差异有统计学rank 值：4.508，P=0.03），见图 1-3。2 年总体生存率，cIAP2的胆囊癌患者组明显（16.7%）低于 cIAP2 低表达的胆囊癌患）。提示 cIAP2 mRNA 高表达的胆囊癌患者预后较差。21 7 14 13.227 23 6 1730 9 21 0.009 14 4 10
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本文编号：2840471