组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2在胰腺癌中的抑癌作用及其分子机制研究

发布时间：2020-10-14 10:09

　　 胰腺癌是全球发病率及死亡率较高的恶性肿瘤之一,根据我国国家癌症中心2015年发布的数据显示,胰腺癌在恶性肿瘤病死率中排名前10,在大城市人群中排名还要更高,胰腺癌术后5年生存率6%。现今,手术切除仍然是唯一可能治愈胰腺癌的手段,但就诊时仅有小部分胰腺癌患者为可切除病灶。且胰腺癌转移倾向明显,即使影像学检查无相关提示,但微转移灶往往已经存在,导致R0切除难以实现,术后复发率在85%以上。胰腺癌对化疗药物吉西他滨等易耐药,生物药物方面虽有Ras等明确促进胰腺癌发生发展的基因被发现,但分子靶向药物难以获得或效果欠佳。30年来,胰腺癌患者术后中位生存期无明显改善。所以,胰腺癌的诊治关键在于积极寻找改善胰腺癌化疗药物耐药的分子及新型生物靶向作用分子为胰腺癌的化疗及生物治疗提供更多可能。组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2(HINT2)具有核苷酸转移酶和水解酶活性,属于组氨酸三联体蛋白超家族,该家族成员蛋白广泛参与细胞增殖、凋亡通路及DNA、RNA和碳水化合物代谢过程。HINT2在早期报道中发现定位于细胞线粒体中,主要存在于哺乳动物的肝脏、胰腺和肾上腺器官中,并发现在肝癌中低表达,进一步研究证明其增加肝癌细胞凋亡敏感性,提示HINT2在胰腺癌中的可能也发挥着重要的作用。第一部分组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2(HINT2)在胰腺癌中具有抑癌作用目的:通过实验证实HINT2在胰腺癌中的抑癌作用及探讨其可能机制。方法:通过免疫组化染色对180个胰腺癌癌组织与癌旁组织样本中HINT2的表达量进行测定并通过与临床资料的结合进行统计分析,确定HINT2表达量与胰腺癌发生发展及患者生存预后关系。而后,在胰腺癌细胞系BxPC-3及L3.6pl中运用腺病毒载体进行HINT2过表达。分别通过流式荧光测定、CCK8实验、划痕实验及Transwell实验确定过表达HINT2之后细胞的周期、凋亡、增殖及侵袭迁移细胞功能学变化,并用Western Blot确定相关蛋白变化。再用HINT2过表达慢病毒载体进行胰腺癌细胞系稳定转染,而后进行集落形成实验及裸鼠皮下成瘤实验确定HINT2对胰腺癌肿瘤细胞生长能力及体内成瘤能力的影响。结果:免疫组化结果显示,胰腺癌和癌旁标本中HINT2表达量存在显著性差异(P0.001),胰腺癌组织中的HINT2表达水平显著低于癌旁组织。经生存曲线分析高表达HINT2组生存时间明显长于低表达组(P0.05)。经过对胰腺癌组织临床资料的整合分析,HINT2表达水平还与胰腺癌的病理分级及淋巴结转移相关(P0.05)。在BxPC-3和L3.6pl两种细胞系中,过表达HINT2的实验组细胞比对照组细胞凋亡增加(P0.05),周期G2期细胞增加(P0.05),实验组中侵袭及迁移过中文生物膜的细胞均比对照组显著减少(P0.05);CCK8结果显示,实验组吸光度值显著低于对照组(P0.05),实验组集落形成减少,裸鼠成瘤体检显著小于对照组(P0.05)。结论:HINT2在胰腺癌组织中表达显著低于癌旁组织,与患者生存期长短相关,且与病理分级和淋巴转移有联系。过表达HINT2胰腺癌细胞系相比于对照组在细胞功能学和裸鼠成瘤实验中均展现出了抑制癌症发生发展的结果。第二部分组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2(HINT2)通过与线粒体钙离子单向转运体(MCU)相互作用促进胰腺癌细胞凋亡目的:通过实验证明HINT2通过与线粒体钙离子单向转运体(MCU)的相互作用从而引起线粒体内钙离子超载,最终导致胰腺癌细胞的凋亡。方法:通过腺病毒载体转染胰腺癌细胞系BxPC-3,使细胞系过表达HINT2。将HINT2过表达细胞用钌红(Ruthenium Red,RR)处理24-48小时后以达到阻滞线粒体钙离子单向转运体(MCU)的目的。后通过AnnexinV/PI凋亡试剂,活性氧(ROS)检测试剂及线粒体膜电位JC-1试剂进行对照组、HINT2过表达组及RR组的细胞处理,流式细胞仪探测荧光值。用Rhod-2 AM染料特异性染胰腺癌线粒体内钙离子,流式细胞仪探测荧光值。Western Blot技术确定MCU复合体相关蛋白变化。结果:过表达HINT2的细胞相比与对照组凋亡细胞明显增多,活性氧水平(ROS)升高,线粒体膜电位(△ψm)下降(P0.05)。但是经过线粒体钙离子通道阻滞剂钌红(RR)处理后,凋亡细胞增多、ROS水平升高及线粒体膜电位(Aψm)下降趋势均被抑制。Western Blot结果显示,过表达HINT2后MCU复合体中门控分子MICU1及MICU2表达均显著下降,EMRE有所升高。经过Rhod-2AM特异性染色处理显示,过表达HINT2细胞线粒体钙离子含量显著升高,并且合用吉西他滨(Gemcitabine)后有进一步升高趋势,但是线粒体钙离子浓度可被红(RR)处理抑制。结论:本研究表明,HINT2通过影响线粒体钙离子单项转运体(MCU)复合体的门控分子,使线粒体内钙离子超载,从而引起线粒体膜电位下降,ROS升高,诱导了胰腺癌细胞的线粒体途径凋亡。第三部分组氨酸三联体核苷酸结合蛋白2(HINT2)与吉西他滨对胰腺癌细胞凋亡有协同作用目的:通过实验证明HINT2与吉西他滨共同作用于胰腺癌细胞具有凋亡协同效应。方法:将BxPC-3细胞分为4组,分别用对照病毒及HINT2过表达腺病毒进行转染后,再分别用PBS及1μM盐酸吉西他滨处理2448小时。通过Annexin V/PI凋亡试剂经流式细胞仪探测荧光值确定细胞凋亡率。将BxPC-3细胞接种于96孔板中,分别用对照病毒及HINT2过表达腺病毒处理后,加入不同浓度盐酸吉西他滨24小时后进行CCK-8检测,通过数据处理得出量效曲线及IC50值。Western Blot技术确定腺病毒转染及经过盐酸吉西他滨处理后HINT2及凋亡相关蛋白的变化。结果:HINT2与吉西他滨联合作用于胰腺癌细胞,使胰腺癌细胞凋亡率增加并且多于单因素作用,表明两者对于胰腺癌细胞凋亡具有协同作用。HINT2过表达组相比于对照组吉西他滨处理后的IC50有显著降低,表明HINT2可以增加胰腺癌细胞对吉西他滨的药物敏感性。Western Blot结果显示过表达腺病毒处理后HINT2有所增加,并且加用吉西他滨处理后,HINT2表达量进一步上升,凋亡相关蛋白在单用过表达腺病毒处理组及吉西他滨处理组均有明显升高,两者联用升高趋势更加明显。结论:本实验结果表明,HINT2与吉西他滨对胰腺癌细胞凋亡具有协同作用,并且吉西他滨可以增加细胞内HINT2表达量,HINT2可以增加细胞对吉西他滨药物敏感性。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.9
【部分图文】：

为了确定组织芯片中１８０例胰腺癌和癌旁组织中的ＨＩＮＴ２含量，我们团队运用??ＨＥ染色，特异性ＨＩＮＴ２—抗和免疫组化染色技术，将组织标本进行染色。观察到??ＨＩＮＴ２在胰腺癌中的染色强度明显弱于癌旁组织（图１－１）。为了进一步进行统计??分析，我们运用打分方式将ＨＩＮＴ２的染色强弱进行量化，０－２分为低表达ＨＩＮＴ２，??＞２分为高表达ＨＩＮＴ２组，进行统计后发现胰腺癌组织的ＨＩＮＴ２低表达的例数要明显??高于癌旁俎织（尸＜０．００１）（表１－３）。??Ａｄｊａｃｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ＰＤＡＣ??图１－１组织芯片ＨＥ染色及免疫组化染色。染色结果显示胰腺癌组织ＨＩＮＴ２表??达低于癌旁组织。（标尺表示２５０ｕｍ长度，右下角为原图片基础上４倍放大）??２０??

量和淋巴结转移以及病理分级相关，Ｐ值分别为０．０１０８和０．０１６１?（表１－４）。联合患??者生存时间绘制Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲线，发现ＨＩＮＴ２的表达量和胰腺癌患者生存预??后相关，ＨＩＮＴ２表达低的患者预后相对较差（图１－２）。??表１＞４胰腺癌ＨＩＮＴ２表达量和临床病理表现关系??Ｖａｒｉａｂｌｅ?ＨＩＮＴ２?Ｓｔａｉｎｉｎｇ?Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ?Ｐ?ｖａｌｕｅ??ｎｕｍｂｅｒ?Ｌｏｗ?Ｈｉｇｈ??Ｉｎ?ｇｅｎｅｒａｌ??Ｔｕｍｏｕｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ?１００?７２?２８??Ｇｅｎｄｅｒ??Ｍａｌｅ?６３?４７?１６?０．４４９３??Ｆｅｍａｌｅ?３７?２５?１２??Ａｇｅ??＞６５?３７?２５?１２?０．４４９３??＜６５?６３?４７?１６??Ｔｕｍｏｕｒ?ｓｉｚｅ??＜２?ｃｍ?４?２?２?０．３１１８??＞２?ｃｍ?９６?７０?２６??Ｐｅｒｉｎｅｕｒａｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ??Ｙｅｓ?４０?３３?７?０．０５６２??２１??

为了明确ＨＩＮＴ２在胰腺癌中的作用，将ＢｘＰＣ－３和Ｌ３．６ｐｌ两个细胞系进行ＨＩＮＴ２??过表达腺病毒的转染，ＭＯＩ值为１００，转染７２小时后换液，之后提取蛋白进行ＷＢ??实验发现过表达组ＨＩＮＴ２的蛋白表达水平约为对照组１０倍（图１－３）。??ＢｘＰＣ－３?Ｌ３．６ｐｌ??ＡＤ－ＮＣ?ＡＤ－ＨＩＮＴ２?ＡＤ－ＮＣ?ＡＤ－ＨＩＮＴ２??３－ａｃｔｉｎ??ＨＩＮＴ２?ｍ＼??０．１３?１．２７?０．２４?２．２５??图１－３?ＢｘＰＣ－３和Ｌ３．６ｐｌ两个细胞系进行ＨＩＮＴ２过表迖腺病毒的转染后ＨＩＮＴ２??表迗量为对照组１０倍。??将转染病毒后的细胞用Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ／ＰＩ试剂进行染色后用流式细胞仪检测荧光??强度。Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ（＋）／ＰＩ（－）染色的细胞表示处于调亡早期的细胞，而Ａｎｎｅｘｉｎ??Ｖ（＋）／ＰＩ（＋）的细胞表示为凋亡晚期的细胞。在ＢｘＰＣ－３细胞中过表达组凋亡细胞??（Ｑ２＋Ｑ４区）要明显多于对照组（对照组１９．９３±０．８６％ｖｓ．?ＨＩＮＴ２过表达组２８．０７??士?４．３１％，尸＜?０．０５）。在Ｌ３．６ｐｌ细胞系中也有相似结果（对照俎１３．４３?±?２．６１?％?ｖｓ．??ＨＩＮＴ２?过表达组?３１＿４７±４．６２％，尸＜０．０１）（图?１－４Ａ－Ｂ）。??用周期试剂染色过表达病毒及对照病毒转染后的ＢｘＰＣ－３细胞系，通过流式细??胞仪进行分析各个细胞周期所占细胞比例，结果显示，过表达ＨＩＮＴ２组Ｇ０／Ｇ１细??胞比对照组少，伴随Ｇ２／Ｍ期细胞增多（Ｇ０／Ｇ１期对照组３４．８２±０．７３?％ｖｓ．?ＨＩＮＴ２??过表达组?２２．０８?±?０．７３％
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2840532