LIN28B在胃癌中的表达及其与临床预后的相关性研究

发布时间：2020-10-14 20:25

　　 研究背景:胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤,据最新研究报道,我国每年胃癌新发病人数为697,000例,胃癌相关死亡人数为499,000例[1]。从世界范围来看,我国每年胃癌发率和死亡率均为世界平均水平的2倍多,且绝对数量位居世界首位[2]。目前,根治性手术联合辅助化疗的综合治疗方案是临床上治疗胃癌的常规方法,且手术仍然是可能治愈胃癌的唯一手段。但由于我国医疗条件和普查意识的不足,大多数患者(80-90%)在首次诊断时已经发展至进展期胃癌,术后复发率和转移率偏高,甚至部分患者在首次明确诊断时已经无法进行根治性手术[3,4]。对于接受了根治性手术或有效放化疗的进展期胃癌患者,五年生存率仍不理想(40%)[5]。基于上述情况,深入探究胃癌的生物学特性,寻找胃癌复发、转移、进展及化疗耐药的相关基因,对进一步提高胃癌综合疗效,改善胃癌患者近期和远期预后具有重大意义。研究表明,LIN28B是一个与恶性肿瘤发生、发展相关的基因。在人类基因组中,LIN28B定位于6q21染色体,基因编码区含有25 0个氨基酸残基,与其同源的LIN28A序列高度相似,相似度达76%[6]。LIN28B所编码的蛋白属于一种高度保守的小RNA结合蛋白,具有将人类成纤维细胞重新编码为多能干细胞的能力,在调节细胞生长、分化、新陈代谢以及多能性方面起到极为重要的作用[7]。LIN28B蛋白在干细胞组织和胚胎组织中存在高表达,随着组织细胞的不断分化成熟,其表达随之降低,但在部分人类恶性肿瘤组织中出现反常高表达现象,并在维持肿瘤干细胞“干性”方面起着重要作用[8,9],故其被认为是“癌胚基因”。国内外研究提示,LIN28B主要通过let-7 micro RNA的双向负反馈调节环路发挥其生物学作用[10]。mi RNA是最近几年来基础和临床研究的热点,是非编码RNA家族中的一支,属于非编码单链RNA分子,能够在转录后抑制靶标m RNA的翻译甚至降解其翻译产物,从而实现基因沉默的关键作用;在与靶基因的m RNA结合之后,对细胞分化、增殖、代谢、凋亡和应激方面都会产生极为重要的影响。研究发现,mi RNA的调控失调是恶性肿瘤发生的重要因素之一,常在恶性肿瘤中出现低表达特征[10,11]。LIN28B可通过双向负反馈调节环路来抑制let-7 mi RNA家族转录后的成熟,从而实现其促癌作用。研究人员于1993年首次在人基因组中发现let-7,其属于非编码micro RNA中的重要家族之一,在维持人体胚胎干细胞分化和可塑性状态方面起到极为重要的作用[10,12]。另一方面,越来越多的实验表明,LIN28B在肿瘤干细胞形成中起到重要作用,是肿瘤干细胞重要的表面分子标志物[13]。它不仅可以促进纤维母细胞重新编码为多能干细胞,而且还可维持肿瘤中“干样”细胞的稳定性。综上,LIN28B非常可能参与了胃癌的发生和发展。此外,转移和复发是导致胃癌患者死亡的主要原因。最新研究结果表明,在胃癌中LIN28B的高表达与胃癌的复发相关。此外,辅助化疗是胃癌综合治疗的重要一环,奥沙利铂作为最常用的一线用药在但临床上耐药现象较为普遍,严重影响了胃癌化疗效果。因此,研究该耐药现象的内在机制可能有利于提高化疗效果,降低胃癌的复发和转移,改善患者远期预后。第一部分:LIN28B在胃癌组织中的表达量及其与胃癌患者临床病理特征以及预后的相关性分析目的:选取250例病历资料完整的胃癌患者,进行LIN28B表达水平的回顾性分析,以明确LIN28B在胃癌肿瘤组织中表达水平与病理、肿瘤分期、分化以及长期预后的关系。方法:1)选取2005年-2012年,250名病历资料完整及术后大体标本保持完好的胃癌患者,其中100例来自于解放军南京总院,150例来源于西京医院消化外科;2)病理组织HE染色和免疫组化染色;3)对免疫组化染色进行半定量分析并分级;4)LIN28B表达水平与胃癌患者一般资料相关性,采用χ2和t检验进行分析;Kaplan-Meier生存曲线分析胃癌患者预后,单因素和多因素分析采用Cox回归模型。结果:1)胃癌组织中LIN28B蛋白低水平表达患者为96例(38.4%),高表达患者154例(61.6%);2)肿瘤分化程度与相应组织中LIN28B的蛋白表达含量有明显相关性(P=0.001);LIN28B蛋白表达量越高肿瘤分化越差,相反高中分化的胃癌组织中LIN28B蛋白表达含量低;3)LIN28B蛋白低表达胃癌病人5年生存率及中位生存时间明显优于高表达患者(76%vs.41.2%,P0.01);4)多因素分析发现,LIN28B蛋白表达量和临床N分期(淋巴结转移)是独立危险因素,可以作为预测因子。结论:胃癌组织中LIN28B表达含量与肿瘤分化情况有关,但与肿瘤大小、浸润程度无关;LIN28B表达量越高患者预后越差;LIN28B表达量和临床N分期都是预后的独立危险因素,可提示患者预后不良。第二部分:LIN28B在胃癌组织及癌旁正常组织中表达量及其与胃癌新辅助化疗后病理反应的相关性目的:比较LIN28B在癌旁正常组织与胃癌组织中表达含量的差别,并阐明LIN28B蛋白在肿瘤组织中的表达含量对新辅助化疗疗效的影响,及新辅助化疗前后胃癌组织中LIN28B含量的变化。方法:1)选取南京总院2015-2017年新近诊断的进展期胃癌患者共24名;2)新辅助化疗前行全腹部增强CT检查,进行临床评估,而后行胃镜检查获取胃癌组织和癌旁正常组织标本;3)所有患者完成2周期新辅助化疗(XELOX)后复查增强CT,进行化疗后评估,然后行D2根治手术;4)化疗疗效临床评估采用RECIST实体瘤疗效评价标准[14],胃癌化疗病理评估根据Becker标准[15];5)通过RT-PCR及免疫组化技术检测LIN28B RNA及蛋白表达量;6)采用Fisher检验统计分析新辅助化疗后临床、病理疗效与LIN28B表达量关系,以及LIN28B在新辅助化疗前后表达量变化;同时利用配对t检验统计分析肿瘤组织与癌旁对应正常组织间LIN28B表达量的差异。结果:1)LIN28B表达量与化疗临床疗效评估结果无关(P=0.432),LIN28B低表达组患者共11例(PR 5例,SD5例,PD1例),高表达组患者共13例(PR 7例,SD3例,PD3例);2)LIN28B表达量与新辅助化疗后病理反应具有相关性(P=0.006),LIN28B低表达组11例(1a级2例,1b-2级8例,3级1例),高表达组13例(1a级0例,1b-2级5例,3级8例);3)新辅助化疗前LIN28B低表达组为9例,高表达为13例,新辅助化疗后低表达组减少到5例,高表达组增加到17例,化疗前后变化具有统计学差异(P=0.002);4)LIN28B的表达量在胃癌组织中要高于相应癌旁正常组织(3.87±0.35 vs.1.95±0.20,P0.01)。结论:癌旁正常组织中LIN28B表达量要明显低于胃癌组织;新辅助化疗前胃癌组织中的LIN28B表达量与化疗病理反应有显著相关性,但与临床评估结果无关,即LIN28B表达量越高,新辅助化疗病理反应越差,故其可作为新辅助化疗疗效的预测指标;新辅助化疗后LIN28B表达量有所升高,其中原因之一可能是由于表达阳性的胃癌细胞易出现化疗耐药,而阴性表达细胞对化疗敏感被杀灭,从而导致阳性表达细胞比例升高所致。第三部分:建立稳定表达LIN28B的胃癌细胞系并对表达LIN28B的胃癌细胞增殖、侵袭及化疗耐药进行体外研究目的:创建持续表达LIN28B的胃癌细胞系,探讨LIN28B的过表达对胃癌细胞增殖、侵袭及化疗耐药的影响。方法:1)选取胃癌细胞系(SGC7901、SGC823及MKN45),采用RT-PCR及WB方法检测LIN28B RAN及蛋白表达含量,选择蛋白表达阴性的SGC7901细胞系进行后续实验;2)使用稳定转染质粒pc DNA3.1+-LIN28B以及pc DNA3.1+作为空白对照,然后利用RT-PCR和WB技术检测LIN28B表达水平;3)采用MTT、细胞克隆形成实验、肿瘤侵袭实验、化疗敏感性实验(奥沙利铂)对比转染后两株细胞特性;4)采用si RNA干扰技术,敲低高表达细胞株的LIN28B表达量,然后再次通过上述实验明确LIN28B的影响;5)采用t检验及方差分析比较各组间差异。结果:1)稳定转染后,SGC7901-LIN28B细胞株的LIN28B的RNA和蛋白表达量明显高于空白对照(P0.01);2)MTT及细胞克隆形成实验提示SGC7901-LIN28B细胞株细胞增殖要明显高于空白对照(P0.05);3)肿瘤侵袭实验表明稳定表达LIN28B的SGC7901-LIN28B细胞株的侵袭能力明显增加(P0.01),同时化疗耐药性增高(P0.05);4)经过si RNA干扰后,高表达细胞的LIN28B表达含量降低,其增殖能力、侵袭性和化疗耐药性相应的出现下降。结论:转染后胃癌细胞LIN28B RNA及蛋白表达量升高,细胞活力和增殖能力明显增强,对化疗(奥沙利铂)耐药性增强,提示LIN28B的高表达能够促进胃癌细胞的增殖,促进其侵袭转移,并增加其耐药性,与促进胃癌的复发、转移及化疗耐药明显相关,从而进一步影响胃癌患者预后。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

-49-图 1.LIN28B 高表达组与低表达组生存比较LIN28B 高表达组（红色，N=154）5 年生存率为 41.2%，中位生存时间为 30 个月；LIN28B 表达组（蓝色，N=96）5 年生存率为 76%，中位生存时间为 65.3 个月，两组相比具有统计学异（P＜0.01）。

-74- 3 使用 RT-PCR 技术检测 LIN28B RNA 在胃癌组织及癌旁组织中表达水24 名患者接受新辅助化疗前的胃癌组织及相应癌旁正常组织 LIN28B RNA 表达水GC 胃癌组织，GN 癌旁正常组织）；（B）配对 t 检验比较胃癌组织和正常组织 LI表达量（1.93±0.120 vs. 3.75±0.207, **P＜0.01）。

图 4 LIN28B 蛋白在胃癌组织和相应癌旁正常组织中的表达水平比较（A）正常组织中 LIN28B 蛋白低表达（×400）；（B）部分胃癌组织中 LIN28B 蛋白低表达（×400）；（C，D）LIN28B 在胃癌组织中高表达（×100，×400）；（E，F）采用 WB 检测 12 例LIN28B 蛋白在胃癌组织及相应癌旁正常组织表达水平比较（注：GC 胃癌组织，GN 癌旁正常组织）；（4.29±0.928 vs. 1.65±0.387，**P＜0.01）。
【参考文献】

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1 胡祥;;日本《胃癌治疗指南》(第3版)解读[J];中国实用外科杂志;2010年01期

2 陈宝敏;董军;沈云天;王中勇;宋武超;黄强;兰青;;人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2放射耐受及其相关机制的初步研究[J];中国现代神经疾病杂志;2008年05期

3 张淑群,强水云,杨文彬,姜建涛,纪宗正;Survivin蛋白在乳腺癌发生、发展不同阶段的表达及意义[J];癌症;2004年06期

本文编号：2841146