信号转导和活化转录因子3加重肝癌细胞上皮—间质转化及促进肝细胞肝癌进展的分子机制研究

发布时间：2020-10-15 00:22

　　 背景和目的:上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关。异常激活的白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)/Janus蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosinekinase,JAK)/信号转导和活化转录因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路能够促进肿瘤细胞上皮-间质转化的发生,促进肿瘤的进展,但其在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发病机制中的研究仍较少。本实验通过体外研究探讨IL-6/JAK/STAT3和Smad3(Sekelsky mothers against d PP 3,Smad3)/转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号通路在肝癌细胞EMT发生过程中的相互作用及分子机制。方法:体外培养肝癌细胞株Hep G2、Bel7402、MHCC97H、HCCLM3,依据四种肝癌细胞株中的磷酸化信号转导和活化转录因子3(phosphorylated STAT3,pSTAT3)的蛋白表达情况,选择肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3进行研究。分别或联合予TGF-β1、IL-6、α-氰基-(3,4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG490)处理肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3后,采用实时定量聚合酶链反应检测锌指转录因子(Zinc finger transcriptional factor,Snail)的信使核糖核酸(messenger Ribonucleic Acid,m RNA)表达水平,蛋白免疫印迹法检测p-STAT3/STAT3、p-Smad3(phosphorylated Sekelsky mothers against d PP 3)/Smad3及EMT相关分子标志物Snail、E-钙黏蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、波形蛋白(Vimentin,Vim)蛋白表达水平。结果:以TGF-β1(0,2,5,10ng/ml浓度)孵育肝癌细胞株(Hep G2)24小时后,首先,我们观察到肝癌细胞株Hep G2细胞逐渐失去原有的极性,由圆形或者椭圆形(上皮表型)逐渐转变为梭形或者典型的成纤维细胞样表型(间质表型),随着TGF-β1孵育浓度的增高,间质表型的改变也更加明显,以TGF-β1 10ng/ml浓度孵育的作用最显著;其次,我们收集Hep G2细胞后提取细胞蛋白检测,发现TGF-β1处理Hep G2细胞24小时后,E-Cadherin的蛋白表达水平降低,Vimentin、Snail、p-STAT3的蛋白表达水平升高,且与TGF-β1的剂量成正相关,而STAT3的蛋白表达水平未见明显变化。随后以TGF-β1 10ng/ml浓度孵育肝癌细胞株Hep G2不同时间点(0,0.5,1,2,4,8小时)后,我们收集Hep G2细胞后提取细胞蛋白检测,发现随着TGF-β1孵育时间的延长,p-STAT3、Snail、p-Smad2、pSmad3的蛋白表达水平逐渐升高,STAT3、Smad4的蛋白表达水平未见明显变化。证明TGF-β1可诱导肝癌细胞株Hep G2的EMT转化,以TGF-β1 10ng/ml刺激8小时效果最显著。以IL-6(0,50,100ng/ml浓度)孵育肝癌细胞株(Hep G2和HCCLM3)1小时后,我们收集Hep G2、HCCLM3细胞后提取细胞蛋白检测,发现在这两种肝癌细胞株中,p-STAT3的蛋白表达水平均随着IL-6孵育浓度的增加而逐渐升高,以IL-6 100ng/ml浓度组p-STAT3蛋白上调最明显。分别或联合予TGF-β1 5ng/ml、IL-6 50ng/ml孵育肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3 1小时后,首先,我们收集Hep G2、HCCLM3这两种细胞后提取细胞m RNA行q RT-PCR检测,发现IL-6+TGF-β1联合处理组较单用TGF-β1组的Snail m RNA表达水平升高更明显(TGFβ1+IL-6 versus TGF-β1:Hep G2 p=0.003;HCCLM3 p=0.008);其次,我们收集Hep G2、HCCLM3细胞后提取细胞蛋白检测,发现在这两种肝癌细胞株中IL-6+TGF-β1联合处理组相比于单用IL-6或TGF-β1组的p-Smad3和Snail蛋白表达水平显著上调,同时显著降低E-Cadherin的蛋白表达水平、升高Vimentin的蛋白表达水平,证明IL-6+TGF-β1联合处理组较单用IL-6或TGF-β1组促进肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3发生EMT的效果更显著。AG490是一种JAK2的特异性抑制剂,以AG490(0,50,100u M浓度)孵育肝癌细胞株(Hep G2和HCCLM3)4小时后,我们收集Hep G2、HCCLM3细胞后提取细胞蛋白检测,发现在这两种肝癌细胞株中,p-STAT3的蛋白表达水平均随着AG490孵育浓度的增加而逐渐降低,以AG490 100u M浓度组p-STAT3蛋白下调最明显。分别或联合予TGF-β1 5ng/ml、AG490 50u M孵育肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3 4小时后,首先,我们收集Hep G2、HCCLM3这两种细胞后提取细胞m RNA行q RT-PCR检测,发现AG490+TGF-β1联合处理组较单用TGF-β1组的Snail m RNA表达水平显著下调(AG490+TGF-β1 vs TGF-β1:Hep G2 p=0.013;HCCLM3 p=0.022);其次,我们收集Hep G2、HCCLM3细胞后提取细胞蛋白检测,发现在这两种肝癌细胞株中AG490+TGF-β1组相比于单用TGF-β1组的pSmad3和Snail蛋白表达水平显著下调,同时显著升高E-Cadherin的蛋白表达水平、降低Vimentin的蛋白表达水平,证明AG490可显著抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3的EMT发生。结论:STAT3在TGF-β1诱导的肝癌细胞EMT发生过程中作为一个正向调控因子,STAT3信号转导可加重TGF-β1诱导的体外肝癌细胞EMT的发生,从而加重肝细胞肝癌的进展。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

上海交通大学硕士学位论文2.结果 在不同肝癌细胞株中的基础表达水平 STAT3 在肝癌细胞株中的表达情况，我们应用蛋白免疫印胞株（HepG2、Bel7402、MHCC97H、HCCLM3）中 p-ST，结果发现四种肝癌细胞株中 p-STAT3 均呈现基础表达水 HCCLM3 细胞株相比，HepG2 和 Bel7402 中 p-STAT3 表达选取其中 p-STAT3 表达较低的 HepG2细胞株和 p-STAT3表胞株用于细胞实验（图 1）。

图 2 TGF-β1 诱导肝癌细胞 HepG2 发生 EMTFigure 2 The occurrence of EMT can be induced by TGF-β1 in HepG2图 2 倒置显微镜观察不同浓度 TGF-β1(0, 2, 5,10ng/ml)刺激 HepG2细胞培养 24小时后细态学的变化（×10）。2.3 TGF-β1 诱导的肝癌细胞 EMT 发生过程中 IL-6/STAT3 信号通路被激活为了观察不同浓度的 TGF-β1处理肝癌细胞 HepG2发生 EMT过程中的相白表达量和 p-STAT3 及 STAT3 表达水平，我们进行蛋白免疫印迹实验结果发着 TGF-β1处理浓度的升高，上皮细胞标志物 E-钙黏蛋白（E-Cadherin, E-Ca达水平逐渐下降，以 10ng/ml 效果最显著，而反应间质转化的蛋白 Vimenti水平逐渐上调，以 10ng/ml 效果最显著。同时 p-STAT3、Snail 蛋白表达量液升高，而总 STAT3 表达量不变。此实验从蛋白表达水平再次证明 TGF-β1 可HepG2 发生 EMT 且处理效果与其浓度呈正相关，同时 EMT 发生过程中伴

gure 2 The occurrence of EMT can be induced by TGF-β1 in HepG2观察不同浓度 TGF-β1(0, 2, 5,10ng/ml)刺激 HepG2细胞培养 24小时10）。导的肝癌细胞 EMT 发生过程中 IL-6/STAT3 信号通路被激不同浓度的 TGF-β1处理肝癌细胞 HepG2发生 EMT过程中p-STAT3 及 STAT3 表达水平，我们进行蛋白免疫印迹实验结理浓度的升高，上皮细胞标志物 E-钙黏蛋白（E-Cadherin, E降，以 10ng/ml 效果最显著，而反应间质转化的蛋白 Vim，以 10ng/ml 效果最显著。同时 p-STAT3、Snail 蛋白表达STAT3 表达量不变。此实验从蛋白表达水平再次证明 TGF-EMT 且处理效果与其浓度呈正相关，同时 EMT 发生过程中通路的激活。
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本文编号：2841412