IL-11促进NSCLC进展并与患者不良预后相关

发布时间：2020-10-16 14:56

　　 目的:探究IL-11在非小细胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma NSCLC)进展中的作用以及相关调控机制。方法:(1)构建敲低以及过表达IL-11的A549及H1299细胞系,利用平板克隆、增殖曲线、Brd U掺入实验分析敲低IL-11或过表达IL-11后对细胞增殖的影响;在过表达IL-11的A549及H1299细胞系,加入Ig G或IL-11中和抗体后,分析阻断IL-11后细胞增殖能力的改变。(2)将用scramble或sh IL11-1处理的A549细胞注射到雌性裸鼠的右侧背部,探究IL-11对体内成瘤的影响。(3)在敲低以及过表达IL-11的A549及H1299细胞系,利用迁移实验、划痕实验、侵袭实验分析敲低IL-11或过表达IL-11对细胞迁移以及侵袭能力的影响;在过表达IL-11的A549及H1299细胞系,加入Ig G或IL-11中和抗体后,分析阻断IL-11后对细胞迁移以及侵袭能力的影响。(4)将用scramble或sh IL11-1处理的A549细胞注射到雌性裸鼠尾静脉,观察并记录小鼠肺部转移肿瘤的发生以及小鼠生存周期。(5)在敲低IL-11的A549细胞系中,采用免疫荧光方法检测EMT标志物的改变;在敲低IL-11的A549及H1299细胞系,检测细胞中EMT标志物的表达水平;在过表达IL-11的A549及H1299细胞系,加入Ig G或IL-11中和抗体后,分析阻断IL-11后对细胞中EMT标志物表达水平的影响。(6)在敲低IL-11的A549及H1299细胞系,采用WB方法检测IL-11是否参与STAT3和AKT信号途径,同时采用免疫组化方法检测小鼠皮下异种移植肿瘤中活化的STAT3的表达水平。(7)探究NSCLC细胞在常氧与缺氧条件下HIF-1α,IL-11的表达水平;在常氧条件下,加入HIF-1α降解阻断剂后检测IL-11的表达水平。(8)通过q RT-PCR分析18个NSCLC患者的肺癌样品和5个正常肺样品中的IL-11表达水平,并分析在线数据库中IL-11的表达水平与患者的预后的相关性。结果:(1)成功构建敲低以及过表达IL-11的A549及H1299细胞系,敲低IL-11后抑制NSCLC细胞的增殖能力,而过表达IL-11后可增强NSCLC细胞的增殖能力,同时加入IL-11的中和抗体可逆转IL-11诱导增强的增殖能力。(2)在小鼠皮下成瘤实验中,与注射对照组细胞的小鼠相比,注射敲低IL-11细胞组的小鼠皮下成瘤能力显著下降。(3)在敲低以及过表达IL-11的A549及H1299细胞系,敲低IL-11后抑制NSCLC细胞的迁移与增殖能力,而过表达IL-11后可增强NSCLC细胞的迁移与侵袭能力,同时加入IL-11的中和抗体可逆转IL-11诱导增强的迁移与侵袭能力。(4)在小鼠肺部转移模型中,与注射对照组细胞的小鼠相比,注射敲低IL-11细胞组的小鼠肺部转移能力明显降低。(5)细胞免疫荧光分析发现,与对照组相比,上皮标志物E-钙粘蛋白、ZO-1蛋白在敲低IL-11的A549细胞中表达增高,相反,间质标志物波形蛋白的表达受到抑制;同时WB结果显示,敲低IL-11后可上调E-钙粘蛋白,紧密连接蛋白-1和ZO-1表达,同时抑制波形蛋白和N-钙粘着蛋白的表达,过表达IL-11可得到相反的结果;在过表达IL-11的A549及H1299细胞系,加入Ig G或IL-11中和抗体后,可逆转IL-11诱导的EMT的发生。(6)STAT3和AKT信号途径分析,IL-11可激活NSCLC中STAT3和AKT信号途径;同时与对照组小鼠相比,敲低IL-11可抑制小鼠皮下异种移植肿瘤中STAT3的表达。(7)与常氧条件相比,NSCLC在缺氧条件下HIF-1α,IL-11的表达水平明显增高;在常氧条件下,加入HIF-1α阻断剂后IL-11的表达水平明显增高,表明缺氧通过HIF-1α诱导NSCLC中IL-11表达增高。(8)肿瘤样品中的IL-11表达水平显著高于正常肺样品;此外,来自在线数据库的公开数据显示IL-11的高表达水平与患者的不良预后明显相关。结论:我们的研究结果表明,IL-11可促进NSCLC细胞的增殖、迁移与侵袭;IL-11参与缺氧反应和EMT;IL-11在NSCLC患者中表达上调并与患者不良预后相关;阐明IL-11促进NSCLC进展机制可为NSCLC的治疗提供新的研究方向。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

图 1.1：A: 用 shIL11-1，shIL11-2 或 scramble shRNA 感染 A549 和 H1299 细胞后检测 IL-11mRNA 水平；B: 用 shIL11-1，shIL11-2 或 scrambleshRNA 感染 A549和 H1299 细胞后，检测细胞上清中 IL-11 的水平。*, P<0.05, * *,P<0.01。1.2.2 敲低 IL-11 抑制 NSCLC 细胞增殖我们检测了敲低 IL-11 对 A549 和 H1299 细胞增殖的影响。首先，我们进行集落形成测定，与对照细胞组相比，敲低 IL-11 后可抑制细胞集落形成（图 C 和D）。为了进一步证实这些发现，我们进行了 A549 和 H1299 细胞的细胞增殖曲线检测，如图 E-F 所示，与对照组相比，敲低 IL-11 后，A549 细胞和 H1299 细胞表现出增殖抑制。胸苷类似物 BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）可以在分裂过程中自然并入增殖细胞的 DNA 中，我们检测了敲低 IL-11 是否影响 BrdU 掺入，如图G 所示，敲低 IL-11 可显著抑制 A549 和 H1299 细胞中的 BrdU 掺入。

图 1.2C: 集落形成实验中 A549 细胞代表性形成集落。D:A549 和 H1299 细胞对照组，shIL11-1 组和 shIL11-2 组集落形成数。E-F: 通过 MTS 测定 A549 和 H1299细胞对照组，shIL11-1 组和 shIL11-2 组的增殖曲线。G:A549 和 H1299 细胞对照组，shIL11-1 组和 shIL11-2 组 BrdU 掺入测定结果。*, P<0.05, * *, P<0.01。1.2.3 NSCLC 细胞过表达 IL-11 效率验证为了进一步证实 IL-11 促进 NSCLC 细胞增殖，在 A549 和 H1299 细胞中过表达 IL-11。qRT-qPCR 和 ELISA 实验证实 IL-11 过表达成功。（图 H-I）。

图 1.3 H:用空载体质粒或过表达质粒在 A549 和 H1299 细胞中过表达 IL-11 后检测细胞中 IL-11mRNA 水平；I: 用空载体质粒或过表达质粒在 A549 和 H1299 细胞中过表达 IL-11 后检测细胞上清液中 IL-11 浓度。*, P<0.05, * *,P<0.01。1.2.4 过表达 IL-11 促进 NSCLC 细胞增殖与对照组相比，A549 和 H1299 细胞过表达 IL-11 后形成的细胞集落增多（图J 和 K），并且细胞增殖率也明显增大（图 L 和 M）。此外，过表达 IL-11 可增强A549 和 H1299 细胞中的 BrdU 掺入（图 N）。然而，当加入 IL-11 中和抗体时，IL-11 诱导增强的增殖能力受到显著抑制（图 J-N）。并且，IL-11 以剂量依赖性方式增强 A549 与 H1299 细胞中的 BrdU 掺入（图 O）。
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本文编号：2843406