目的:探讨(mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS))多功能栓塞微球的物化性能表征及CT成像、微波增敏、ZrO2@(DOX+ILS)释放功能的体外实验研究方法:(1)空白mPEG-PLGA微球和mPEG-PLGA@ZrO2@(ILs+DOX)微球的形貌和粒径通过光学显微镜(OM UB100i)和扫描电子显微镜(SEM,S-4300,Hitachi)观察,用Nano Measurer(粒度分析软件)测量100个微球的粒径测定其粒度分布。SEME-EDS用来测定元素的种类和面分布。(2)取不同浓度(0,1.25mg/ml,2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)的溶液放入PE管内,利用西门子双源CT进行扫描,观察不同浓度的CT值。(3)将30 mg mPEG-PLGA@ZrO2@(ILs+DOX)微球分散在1ml的生理盐水中,与生理盐水做对比,应用功率为1.8 W的微波照射5 min,红外热成像仪实时监测消融区域的温度变化,统计消融中心区域及距离消融中心1cm区域的温度。用明胶水凝胶模拟人体环境,将材料均匀的分散到水凝胶中(浓度5mg/m L),与无材料的明胶水凝胶做对比,用功率为4W微波照射2min,消融后统计水凝胶融化的面积。(4)ZrO2@(ILs+DOX)的释放试验中,将浓度为3mg/m L的微球分别置于37℃和65℃下孵育10min,3000r/min下离心,SEM观察离心的底物mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)的形状,TEM观察上清液中的ZrO2@(DOX+ILS)数量。结果:(1)光学显微镜和扫描电镜下,空白材料(mPEG-PLGA)呈规则的球形,且具有良好的分散性,尺寸分布在35-65μm之间,平均粒径为43.1μm。mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球的光学照片,扫描电镜照片及粒度统计,包覆ZrO2@(DOX+ILS)后并未影响材料的形貌极其分散性,平均粒径变为48.66μm,略有增加。SEM-EDS测试发现,材料中含有的C,Zr,P,F,N分别来自mPEG-PLGA骨架,ZrO2,1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和阿霉素。(2)显示含有mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球的溶液密度随着浓度的增加而亮度升高,CT值随着浓度增加而升高,呈线性关系(3)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)溶液,与生理盐水相比消融中心区域升温效果(30±7.49℃,17±5.63℃),两者具有统计学差异(P0.001),距离消融中心1cm处的升温效果(18.51±7.64℃,6.91±1.91℃);材料组的消融面积比对照组提高了30.6%。(4)在37℃下,微球的形貌并未发生明显变化,释放后的上清液仅仅发现极少的ZrO2@(DOX+ILS),说明微球并未出现明显热感应,在65℃下,微球出现变形破裂的现象。透射电镜下释放后的上清液中出现了大量的ZrO2@(DOX+ILS)。结论:1、证明了ZrO2@(DOX+ILS)被成功包覆到mPEG-PLGA空白微球当中。2、在体外的实验研究中,mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有CT成像功能;3、在体外的实验研究中,mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有微波增敏功能;4、在体外的实验研究中,微波加速mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球中ZrO2@(DOX+ILS)颗粒及阿霉素释放。目的:探讨mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球在兔VX2肝肿瘤模型的血管栓塞和阿霉素缓释功能。方法:(1)选取9只瘤兔,肿瘤大小直径在1.2cm左右,随机分成3组(1天,6天,9天),每组3只,经肝动脉注入mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球,术后1天,6天,9天各处死三只瘤兔,取肿瘤组织,心肺肾脾组织,进行组织学检测及冰冻切片。(2)动脉血管的栓塞作用:肝动脉注入多功能微球后利用DSA观察正常兔肝动脉栓塞情况;经肝动脉超选择肿瘤供血动脉利用DSA观察肿瘤染色;术后24小时利用CT扫描观察肿瘤的留药情况(3)冰冻切片及HE染色观察肿瘤内外阿霉素荧光的分布,利用Image J软件进行半定量对比分析(4)冰冻切片观察术后1天、6天、9天阿霉素在肿瘤组织内荧光,并用Image J软件进行半定量分析(5)冰冻切片观察术后1天、6天、9天阿霉素在心肺脾肾内荧光及心肺脾肾组织的HE染色,利用Image J软件进行各组织荧光半定量分析。结果:(1)在DSA引导下,对正常兔经肝动脉注入一定量的mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球,造影显示肝左右动脉血管影消失;在对VX2肝肿瘤兔进行mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球肿瘤血管栓塞的实验过程中,显示肿瘤的供血血管部分被mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球栓塞,肿瘤区域浓聚,栓塞剂存留。栓塞24小时后,CT断层扫描可见肝脏内低密度的肿瘤区域呈现明显的高密度。(2)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球治疗后,使微球栓塞在肿瘤血管内,阿霉素能够在瘤组织内大量释放,而周边的正常的肝组织内只有少量的阿霉素),应用image J软件进行半定量分析,可见肿瘤内的阿霉素颗粒明显高于肿瘤外。HE染色显示肿瘤组织内可见大量的黑色颗粒(载阿霉素的二氧化锆);(3)阿霉素光在荧光显微镜下呈现红光,1天肿瘤组织内可见少量阿霉素荧光,6天及9天可见大量阿霉素荧光,利用Image软件半定量分析显示所示,6天肿瘤内阿霉素的个数最多(4)术后1天脾脏内可见少量阿霉素荧光,心肺肾内未见明显的阿霉素荧光;术后6天心肺脾肾内可见少量阿霉素荧光,术后9天,心肌内未见阿霉素荧光,肺脾肾内可见少量阿霉素荧光。(5)治疗1天6天9天后HE染色,肺脾肾心肌组织未见异常改变。结论:(1)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有血管栓塞的作用(2)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球经肝动脉超选择注入肿瘤血管内,阿霉素主要存留在肿瘤组织内(3)mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球具有阿霉素缓释的作用目的:探讨肝动脉注入阿霉素缓释、微波增敏功能的多功能栓塞微球在VX2肝肿瘤模型中的治疗作用。方法:选取24只瘤兔,肿瘤大小在1.0-1.5cm,随机分成4组,每组6只,A组:空白组,不给予任何治疗;B组:单独给予微波消融;C组:经肝动脉给予mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球(栓塞组);D组:经动脉给予mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球合并微波消融(栓塞+消融组)。对微波组及微波+栓塞组瘤兔进行微波消融(15w,2450f,2min),同时利用红外成像仪实时记录消融中心区域的温度变化,利用软件计算距离消融中心0.5cm区域的温度变化。利用MR DWI序列比较消融后24小时的残留体积大小。比较栓塞组及栓塞+微波组瘤兔24小时肿瘤组织进行冰冻切片,利用荧光显微镜观察的阿霉素荧光,同时取24小时肿瘤组织,进行生物电镜检查,观察细胞的超微细结构及ZrO2在肿瘤细胞内的分布;对各组瘤兔术后3-6-9天自耳缘静脉抽取静脉血,化验肝肾功(AST,ALT,BUN,Cr)及血常规(WBC,RBC,HCT,HGB,MCV,MCH,MCHC,PLT),测量3-6-9天的瘤兔体重变化,评估多功能微球在活体内的生物安全性。利用CT及MRI DWI序列测量术前及术后1-3-6-9天的肿瘤体积大小及残留肿瘤的体积大小,进行肿瘤疗效的评估,利用HE染色,观察各组肿瘤组织病理改变。结果:(1)D组与B组消融中心区域温度达到60℃所需要的时间(5.4±0.89℃,10.4±1.14℃),两组相比较有统计学差异(P0.001)。两组的平均温度(111.75±17.16°C,84.58±17.41°C,P0.01),两组相比较有统计学差异。D组2分钟内消融中心温度最高可以达到130度左右,B组107度左右。红外成像显示D组的消融面积大于B组;D组在消融25S的时间,平均温度升高到60℃,最高温度可以超过100℃,B组在消融2min的时间内,最高温度低于60℃,其两组的平均温度(77.17±16.97℃,47.2±4.57℃,P0.001),差异有统计学意义。两组兔VX2肿瘤治疗24小时,肿瘤残留体积的对比(486.6±63.54mm3,271.6±52.08mm3),二者相比较差异有统计学差异(P0.05)。(2)术后24h,D组肿瘤内的阿霉素免疫荧光明显高于C组(3)术后24小时,D组残瘤细胞的电镜观察,细胞核明显固缩、核膜增厚、染色质凝聚,核内可见黑色高电子密度颗粒的二氧化锆;C组残瘤细胞的电镜观察,细胞结构完整、核大细胞质少、细胞核不规则、可见分裂相。(4)治疗前先对4组动物的基线肿瘤体积进行比较(P0.05),四组之间无统计学差异。治疗后1天、3天、6天、9天,我们进行了CT图像扫描:A组肿瘤体积明显增大,B组及C组体积增大次之,D组在治疗后病灶体积无明显变化。D组与其它三组比较,术后3天、6天、9天肿瘤体积差异均有统计学意义(P0.01);B组与C组之间术后3天,6天、9天肿瘤体积无统计学差异(P0.05),与A组之间在治疗后3天,6天,9天的肿块体积大小差异均有统计学意义(P0.05)(5)术前四组肿块体大小比较无统计学差异(F=0.249,P=0.861),术后1天,3天,6天,9天D组与其它三组活性肿瘤体积大小有统计学差异(P0.001);B组和C组与A组之间活性肿瘤体积有统计学差异(P0.001);B组与C组在术后1天活性肿瘤体积无统计学差异(P0.05),术后3天活性肿瘤体积有统计学差异(P0.001),术后6天活性肿瘤无统计学差异(p0.05)。MR图像显示D组的肿瘤活性组织体积明显缩小,只有病灶边缘残留少量肿瘤组织,其它三组肿瘤活性组织明显增大,特别是A组肿瘤活性组织增大特别明显。(6)D组肿瘤组织内可见满视野的坏死细胞,未见明显肿瘤细胞,B组及C组内可见肿瘤细胞染色,其内可见坏死区,A组内可见大量的肿瘤细胞,坏死不明显(7)D组与C组介入术后3天,AST,ALT明显升高,二者之间无统计学差异,且分别与B组及A组相比较有统计学差异(P0.05),;术后6天,D组与C组AST,ALT明显降低,术后9天,与A组及B组相比较无统计学差异(P0.05)。四组之间3,6,9天的BUN,Cr之间无统计学差异(P0.05)(8)D组、C组及B组术后3天,WBC明显升高,与A组之间有统计学差异(P0.05),但三组之间无统计学差异(P0.05),6天后WBC明显降低,第9天各组之间WBC无统计学差异(P0.05);RBC,HCT,HGB,MCV,MCH,MCHC,PLT各组之间3-6-9天无统计学差异(P0.05)(9)D组与C组动物的体重3天体重减轻,3天后体重增加,第9天与A组及B组之间无统计学差异(P0.05).结论:1、mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球能够起到微波增敏作用,增加消融体积。2、微波可以加速mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球中阿霉素的释放。3、mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)多功能微球在活体内是安全、无毒副作用的。4、mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)辅助微波消融,可以起到栓塞、化疗、微波三位一体的治疗作用,大大的提高了肿瘤治疗的疗效。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
mPEG-PLGA 骨架， ZrO2，1-丁基 -3-甲基咪唑六氟磷酸盐和阿霉素，证明了ZrO2@(DOX+ILS)被成功包覆到微球当中(图 3.1G)。图3.1 空白材料（mPEG-PLGA）A:光学显微镜照片 B:扫描电镜照片 C:粒度统计；mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球 D：光学照片 E：扫描电镜照片 F：粒度统计G：SEM-EDS 能谱分析.
2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,20mg/ml)随着浓度的增加而亮度升高，CT 值升高，呈线性关系（如图 3.2A-B 所示）图3.2A: mPEG-PLGA@ZrO2@(DOX+ILS)微球的溶液体外CT影像; B:浓度与CT值的线性关系3.3 体外微波增敏功能消融中心区的温度微球组与对照组分别为(30±7.49℃,17±5.63℃)，两者具有统计学差异（P<0.001）（图 3.3A）；距离消融中心 1cm 区域的温度微球组与对照组分别为(18.51±7.64℃,6.91±1.91℃），两者具有统计学差异（P<0.001）（图 3.3B）。热红外成像显示,微球组有更好的升温效果和更大的消融面积（图 3.3C)。微球组的消融面积比对照组提高了 30.6%（图 3.3D）。
图 3.3:A 两组消融中心区域的温度升高曲线; B 距离消融中心区域 1cm 的温度升高曲线;C 两组消融区域的红外成像; D 两组消融面积比较3.4 不同温度下 ZrO2@(ILs+DOX)释放的体外实验在 37℃下，扫描电镜观察微球的形貌（图 3.4A）并未发生明显变化。透视电镜下，释放后的上清液仅仅发现极少的 ZrO2@(DOX+ILS（)图 3.4C）；而在 65℃下，扫描电镜观察微球出现变形破裂的现象(图 3.4B)。透射电镜下，释放后的上清液中出现了大量的 ZrO2@(DOX+ILS)（图 3.4D）。
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