干扰NPRL2表达对前列腺癌细胞体外体内凋亡和侵袭转移的研究

发布时间：2020-10-20 18:31

　　 目的:明确NPRL2在前列腺癌中的表达情况以及其对前列腺癌DU145和PC3细胞体外增殖影响;进一步探究干扰NPRL2表达后对前列腺癌细胞DU145和PC3体外凋亡和侵袭转移的影响及其作用机制;深入探讨干扰NPRL2表达后对前列腺癌细胞DU145和PC3体内侵袭转移的影响及其作用机制的探讨。方法:一体外实验:1.体外凋亡检测:1)使用RT-PCR和Western Blot检测人正常前列腺细胞株RWEP-1和前列腺癌DU145和PC3细胞株中NPRL2的表达量;2)对前列腺癌PC3和DU145细胞株进行慢病毒NPRL2 sh RNA转染,首先,通过荧光法确定转染成功,然后对转染后的DU145和PC3细胞株分别从mRNA及protein水平对NPRL2的表达量进行检测;3)对转染后的DU145和PC3细胞株进行增殖能力检测使用CCK-8法;4)运用流式细胞术对转染后的DU145和PC3进行凋亡和周期的检测;5)运用Hoechst染色对转染后细胞的凋亡进行细胞形态学上的检测6)使用RT-PCR和Western Blot对转染后细胞的凋亡蛋白进行检测;7)使用划痕和Transwell对转染后细胞的侵袭转移能力进行检测;8)使用Western Blot及RT–q PCR对NPRL2及其调控的下游PI3K/AKT/GSK-3β信号通路进行检测;2.体外侵袭转移的检测:1)运用Transwell和划痕对前列腺癌DU145和PC3细胞的体外侵袭转移进行检测;2)使用Western Blot及RT–qPCR对NPRL2及其下游的NF-κB/MMP-9信号通路进行检测。二体内实验:体内实验:检测转染后细胞在体内的成瘤率,及成瘤后肿瘤缩减率;使用HE染色观察瘤体中肿瘤细胞的形态变化;使用免疫荧光检测瘤体中凋亡相关蛋白的变化;使用免疫组化法对瘤体中凋亡相关蛋白表达进行检测;使用Western blot及RT-PCR对NPRL2及凋亡和转移相关蛋白和基因进行检测。三数据分析:数据分析:采用SPSS 18.0软件对所有实验数据进行统计学分析。结果:1.与正常的前列腺细胞系RWPE–1相比,NPRL2在前列腺癌细胞系DU145和PC3中的表达量明显上升;2.干扰NPRL2表达后,人前列腺癌细胞DU145和PC3的体外增殖能力明显下降;3.干扰NPRL2表达后,可以有效抑制人前列腺癌细胞DU145和PC3的凋亡和周期;4.干扰NPRL2表达后,可以有效抑制人前列腺癌细胞DU145和PC3的凋亡信号通路PI3K/AKT/GSK-3β的表达;5.干扰NPRL2表达后,可以有效抑制可以有效抑制人前列腺癌细胞DU145和PC3的体外侵袭转移,并对相关通路NF-κB/MMP-9产生影响;6.体内实验证实,干扰NPRL2表达后,可以有效抑制裸鼠体内的肿瘤转移结论:NPRL2在前列腺癌细胞DU145和PC3中高表达,干扰NPRL2的表达可以有效降低前列腺癌细胞DU145和PC3的体外增殖,并可以抑制其侵袭和转移,体内实验证实干扰NPRL2的表达可以有效抑制前列腺癌细胞DU145和PC3体内的增殖和侵袭转移。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

图1-1. RWPE-1和DU145，PC3中NPRL2蛋白和基因水平的变化。注：*P＜0.05 与对照组比较Figure 1-1. The level change of NPRL2 proteins and genes in DU145，PC3 andRWPE-1 cellsNote:*P＜0.05 vs control group2.2 NPRL2 慢病毒转染后阳性克隆的筛选我们采用 NPRL2 特异性 shRNA 慢病毒及 Mock 空载对照慢病毒对 DU145 和PC3 细胞进行转染，然后使用嘌呤霉素进行筛选并挑选出单克隆细胞。然后使用荧光显微镜对转染后的 NPRL2-DU145、Mock-DU145、NPRL2-PC3、Mock-PC3和 PC3 五组细胞进行观察。结果显示，NPRL2-DU145、Mock-DU145、NPRL2-PC3及 Mock-PC3 均可见绿色荧光，而 PC3 组不可见绿色荧光，证明转染成功（图 1.2）。

图 1.4 FCM 检测细胞凋亡Fig.1.4 Cell apoptosis were detected by FCM2.7 FCM 检测过表达 NPRL2 对细胞周期的影响我们通过流式细胞术对转染过 NPRL2 的 NPRL2-DU145、Mock-DU145 和 PC3组细胞及 NPRL2-PC3、Mock-PC3 和 PC3 组细胞进行检测。FCM 结果显示，NPRL2-DU145 组细胞的细胞周期大多在 G0/G1 期，部分在 S 期，对比对照组，过表达 NPRL2 可以有效的将细胞周期阻滞在 G0/G1 期，差异有统计学意义。以上结果表明在前列腺癌细胞中低表达 NPRL2 可以有效抑制细胞周期（表 1.3 图 1.5）。表 1.3 流式细胞术检测细胞周期Name G0/G1(%) S(%) G2/M

图 1.5 FCM 检测细胞周期Fig.1.5 Cell cycle were detected by FCMoechst 染色检测转染 NPRL2 后对各组细胞凋亡的形态学影了检测过表达 NPRL2 对细胞凋亡形态学的影响，我们使用 Hoechst 染色-DU145、Mock-DU145 和 PC3 组细胞及 NPRL2-PC3、Mock-PC3 和 PC行检测。Hoechst 结果显示，与 Mock-DU145 和 DU145 组细胞相比，低L2 的 NPRL2-DU145 组细胞，其细胞核皱缩和破碎程度更加剧烈；同时 也是这样的趋势，证明低表达 NPRL2 可以有效诱导细胞凋亡。（见图
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本文编号：2849011