淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞生长的作用及其机制研究

发布时间：2020-10-21 07:07

　　 背景:髓母细胞瘤是儿童期高发的脑部恶性肿瘤之一,占儿童中枢神经系统恶性肿瘤的15～30%。它起源于小脑蚓部或后髓帆,发生部位多处在小脑的第四脑室上部及小脑蚓部。目前髓母细胞瘤的治疗主要包括手术的完整切除,辅以术后脑部和脊髓的放疗和化疗。手术是髓母细胞瘤非常重要的治疗手段,可以减轻脑积水,降低颅压,明确病理诊断。然而手术治疗常不能根治髓母细胞瘤,因此髓母细胞瘤患者术后常结合放疗或化疗治疗。放疗是根据患者病情不同在术后给予不同程度的放射治疗,可辅助提高患者的生存率和降低术后复发率。然而放疗有可能给患者带来中枢神经系统的远期毒副反应,如听力损伤、认知功能障碍和神经智力发育迟缓等。因此研究者希望能通过联合使用化疗方法进行辅助治疗。髓母细胞瘤的化疗药物主要包括环磷酞胺、长春新碱、卡铂、甲氨蝶呤和依托泊苷等。由于化学合成药物常常具有一定的副作用,近年来天然植物提取物以其副作用较少的优势在肿瘤治疗中的应用日益受到关注,成为肿瘤包括髓母细胞瘤治疗药物筛选的热点方向。因此,筛选新的有效的治疗药物,对髓母细胞瘤获得良好预后具有重要的意义。天然植物提取物在肿瘤治疗中具有重要的意义,因此,越来越多的研究致力于寻找新的更优的可治疗肿瘤的天然植物提取物。淫羊藿苷是小蘗科植物淫羊奮的提取物,又称仙灵脾,味辛、甘,性温,归肝、肾两经,具有补肾壮阳、祛风除湿的功效。现代药理学研究表明淫羊藿苷作为淫羊霍的主要活性成份,具有的补肝肾、强筋骨、祛风湿、抗衰老、提高免疫力、抑制肿瘤等药理作用,是目前多种药物的重要成分,包括抗抑郁类药物、神经保护类药物和免疫调节类药物等。目前已有研究发现,淫羊藿苷通过抑制肿瘤细胞增殖、引起细胞凋亡和周期阻滞、降低细胞侵袭迁移能力等,从而在多种人类肿瘤的治疗中发挥重要作用。然而淫羊藿苷在不同类型肿瘤中发挥作用的机制不尽相同,而且淫羊藿苷在髓母细胞瘤中是否发挥重要作用尚不清楚。基于以上背景,我们对淫羊蕾苷在髓母细胞瘤中的作用及其分子机制展开研究。目的:1、检测淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞增殖的影响。2、检测淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞周期的影响。3、检测淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞周期相关蛋白表达的影响。4、检测淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞凋亡的影响。5、检测淫羊蕾苷对髓母细胞瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响。6、检测淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞成瘤能力的影响。方法:1、将生长状态良好的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341,按照1×106/孔的密度接种到96孔板中,每组设计3个复孔,采用CCK-8方法检测不同浓度淫羊藿苷处理对髓母细胞瘤细胞活力的影响。2、取生长状态良好的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341,接种到6孔板,每组设计3个复孔,调整细胞密度为100个/孔,用结晶紫染色液对形成的细胞克隆染色,并在光镜下观察不同浓度淫羊藿苷处理对Daoy和D341细胞克隆形成能力的影响。3、取对数生长期的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341,用预冷70%乙醇处理细胞,加PI试剂,采用流式细胞仪检测不同浓度的淫羊藿苷对Daoy和D341细胞周期的影响;取对数生长期的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341,收集并定量蛋白,采用western blot方法检测不同浓度的淫羊蕾苷对髓母细胞瘤细胞Daoy和D341细胞中细胞周期相关蛋白表达的影响。4、取对数生长期的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341,采用流式细胞仪检测不同浓度的淫羊藿昔对Daoy和D341细胞凋亡的影响;取对数生长期的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341,收集并定量蛋白,采用western blot方法检测不同浓度的淫羊藿苷对Daoy和D341细胞中细胞凋亡相关蛋白表达的影响。5、构建裸鼠移植瘤模型,在动物水平检测淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞成瘤能力的影响;采用免疫荧光法检测淫羊藿昔对髓母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响;采用western blot方法检测淫羊蕾苷对髓母细胞瘤细胞凋亡相关因子表达的影响。结果:1、淫羊藿苷可抑制髓母细胞瘤细胞Daoy和D341的细胞生长,并且具有剂量和处理时间依赖性。2、淫羊藿苷可明显抑制髓母细胞瘤细胞Daoy和D341的细胞克隆形成能力,且具有剂量依赖性,淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341形成的克隆数量明显较少,且克隆直径明显较小。 _3、淫羊藿苷可引起髓母细胞瘤细胞Daoy和D341的细胞周期S期阻滞:淫羊藿苷处理组S期细胞比例明显较高,而G0期和G2期细胞比例则明显较少;淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341细胞中细胞周期相关蛋白cyclinA、CDK2、cyclinB1的表达水平明显降低。4、淫羊藿苷可诱导髓母细胞瘤细胞Daoy和D341的细胞凋亡,且具有剂量依赖性,淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341出现较多的细胞浓缩、细胞核断裂等特征。此外,淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Daoy和D341早期和晚期凋亡的细胞比例明显升高。免疫印迹显示淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Daoy 和 D341 细胞中促凋亡相关蛋白 Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP蛋白水平的表达明显上升,而抗凋亡因子Bcl-2的表达明显下降。5、淫羊藿苷可抑制髓母细胞瘤细胞体内移植瘤生长,且呈现剂量依赖性。淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞体内移植瘤组织中增殖标志PCNA表达明显下降,而凋亡标志cleaved-caspase-3表达显著上升。与之一致的是,淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞移植瘤组织中促凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP蛋白水平的表达明显上升,而抗凋亡因子Bcl-2的表达明显下降。结论:1、淫羊蕾苷可抑制髓母细胞瘤细胞活力。2、淫羊蕾昔可抑制髓母细胞瘤细胞克隆形成能力。3、淫羊藿苷可诱导细胞周期S期阻滞;淫羊蕾苷通过抑制髓母细胞瘤细胞中细胞周期相关蛋白cyclinA、CDK2、cyclinB1的表达诱导细胞周期S期阻滞。4、淫羊藿苷可引起细胞凋亡;淫羊藿苷通过上调髓母细胞瘤细胞中促凋亡相关蛋白 Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-PARP 的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达而诱导细胞凋亡。5、淫羊蕾苷可以抑制髓母细胞瘤细胞的体内成瘤能力。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R739.41
【部分图文】：

用ＣＣＫ－８方法检测细胞活力。结果显示，淫羊藿苷对两种髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ??和Ｄ３４１的增殖活力均有明显的抑制作用，并且淫羊蕾苷对两种髓母细胞瘤细胞??的抑制作用都是剂量依赖的（图１－１Ａ）。另外，我们采用１０ｐＭ的淫羊藿苷处理??髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１，分别于２４小时、４８小时和７２小时后检测细胞??活力。结果显示，随着处理时间的延长，淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和??Ｄ３４１的抑制作用也随之增强，７２小时后，淫羊藿苷对两种髓母细胞瘤细胞活力??的抑制作用均达到５０％?（图１－１Ｂ）。这些结果表明，淫羊藿苷可抑制髓母细胞瘤??细胞活力，且这种抑制作用具有剂量和时间依赖性。??Ａ?Ｂ??４８ｈ?ｌ〇ｎＭ?口?Ｄａｏｙ??１５〇ｉ?Ｄａｏｙ?１００１?＿?Ｄ３４１??ｇ?－ｍ－?Ｄ３４１?ｇ?８０－?ｊｒ??ｉｉ〇〇＾ｘ?ｉ６〇?ｎ?ｘ?Ｉ．??！?！４０－?ｆｉ?ｌｉｉ??Ｅ?Ｓ２〇－?ＩＩＩ??〇－ｌ???１???？???１???１???１?０－＾—＾？￣￣＾￣＾—??０?１０?２０?３０?４０?５０?１?２?３?１?２?３??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（＾Ｗ）?Ｔｉｍｅ?ａｆｔｅｒ?ｐａｓｓａｇｅ?（ｄａｙｓ）??图１淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１活力的影响。Ａ．不同浓度淫羊藿苷对髓母??细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１活力的影响；Ｂ．淫羊藿苷处理不同时间对髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ??和Ｄ３４１活力的影响。＊：与处理１天时比较

为了验证淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞克隆形成能力的影响，我们使用０，?５，??１０和２（ＶＭ的淫羊藿苷处理髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１。结果显示，淫羊藿??苷处理可以明显抑制髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ（图２－２Ａ，２Ｃ，２Ｄ）和Ｄ３４Ｋ图２－２Ｂ，??２４??

测结果显示，淫羊藿苷处理后的髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１细胞更多的集中??在Ｓ期，而Ｇ１期的细胞相应较少，且随着淫羊藿苷处理浓度的升高，Ｓ期阻滞??程度越高（图３Ａ，?３Ｂ），而且这种抑制作用随着淫羊藿苷处理浓度的提高而增??强。此外，我们对不同浓度淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１中细??胞周期蛋白Ａ、Ｂ１和细胞周期蛋白依赖的激酶ＣＤＫ２的表达进行检测。结果发??现，淫羊藿苷处理的髓母细胞瘤细胞Ｄａｏｙ和Ｄ３４１中ｃｙｃｌｉｎＡ、ｃｙｃｌｉｎＢｌ和ＣＤＫ２??的表达水平均明显受到抑制（图３Ｃ）。这些结果显示，淫羊藿苷能够引起髓母细??胞瘤细胞周期阻滞，从而起到抑制髓母细胞瘤细胞增殖的作用。??２５??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 杨晓非;;Wortmannin对人髓母细胞瘤细胞系Daoy增殖和凋亡的影响[J];现代肿瘤医学;2012年11期

2 李灵敏,冀春萱;小脑髓母细胞瘤的形态学观察[J];临床与实验病理学杂志;2001年05期

3 吴国华,陆冬青,林青,姚原,蒋马伟,翁霞,沈玉成;髓母细胞瘤的放疗和化疗[J];陕西肿瘤医学;1999年03期

4 赵振宇;王良哲;卢明;卢亦成;;S100蛋白在儿童髓母细胞瘤组织中的表达及与预后的关系[J];临床神经外科杂志;2011年01期

5 邓爱平;方文韬;周青罡;杨洪军;王凌;南铁贵;康利平;郭兰萍;黄璐琦;詹志来;;淫羊藿质量影响因素及质控对策分析[J];中国中药杂志;2018年05期

6 赵金玲;;补肾强身片中淫羊藿苷的含量测定[J];黑龙江科技信息;2013年02期

7 关宇强;杨国林;梁纪兰;严作廷;谢家声;李世宏;王东升;;HPLC法测定催情助孕液中淫羊藿苷含量的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2009年11期

8 孔少仪,陈刚梅,周月兰;反相高效液相色谱法测定金蚧片中淫羊藿苷的含量[J];中国药业;2003年10期

9 王欣;王婷婷;王海军;翁代群;阳勇;李青;罗维早;;淫羊藿中淫羊藿苷提取工艺研究[J];重庆中草药研究;2010年01期

10 黄耀广;陈秀英;;RP-HPLC法测定回春胶囊中淫羊藿苷的含量[J];中国药事;2008年01期

相关博士学位论文 前6条

1 孙勇;淫羊藿苷对髓母细胞瘤细胞生长的作用及其机制研究[D];山东大学;2017年

2 付元山;髓母细胞瘤对维甲酸敏感性差异的内在分子机制分析[D];大连医科大学;2010年

3 田龙;淫羊藿苷对勃起功能的作用机制研究[D];武汉大学;2004年

4 李梨;淫羊藿苷对缺血再灌致脑损伤保护作用的实验研究[D];重庆医科大学;2005年

5 肖强兵;淫羊藿甙对人工关节假体松动的作用及其分子机制[D];华中科技大学;2006年

6 王耀;水蛭酶解提取物和淫羊藿苷抑制动脉粥样硬化进展的药理学机制研究[D];山东大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 吴大畅;白藜芦醇诱导髓母细胞瘤细胞分化、凋亡及其相关基因解析[D];大连医科大学;2004年

2 王月圆;PARP-1缺失小鼠髓母细胞瘤细胞系的建立和功能分析[D];中国协和医科大学;2009年

3 李严;BNIP3在人髓母细胞瘤细胞中的表达研究[D];安徽医科大学;2010年

4 于丽君;白藜芦醇调节人髓母细胞瘤细胞Survivin和Bcl-2表达及其生物学意义分析[D];大连医科大学;2006年

5 韩旭;白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞中GRP78、ATP5B和VEGF的表达影响及其潜在生物学意义分析[D];大连医科大学;2015年

6 刘楠;Wnt信号通路状态与白藜芦醇抗髓母细胞瘤细胞作用关系的研究[D];大连医科大学;2007年

7 王稼辉;白藜芦醇对人胶质瘤及髓母细胞瘤细胞蛋白质组调节作用的初探[D];大连医科大学;2015年

8 吴茉莉;白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞CYP1A1和CYP1B1表达的调节作用及其与抗肿瘤作用的相关性[D];大连医科大学;2005年

9 胡月;白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞中VDAC1、CALR表达的调节及其对肿瘤血管生成的影响[D];大连医科大学;2016年

10 范少华;白藜芦醇诱导髓母细胞瘤细胞NF-κB活化的生物学意义分析[D];大连医科大学;2006年

本文编号：2849807