PD-1和TIM-3序贯阻断逆转T细胞凋亡在GM-CSF锚定疫苗治疗转移性膀胱癌的实验研究

发布时间：2020-10-21 19:30

　　 研究背景及目的膀胱癌是泌尿系统中威胁人类健康最常见的恶性肿瘤,肌层浸润性膀胱癌危害尤甚。膀胱癌治疗后的高复发率及其恶性进展的可能与肿瘤微环境(TME)中缺乏肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)以及肿瘤细胞通过免疫逃逸机制逃避了免疫细胞的杀伤密切相关。肿瘤疫苗是通过多种方式将肿瘤抗原接种至宿主体内以获得主动免疫反应,从而产生抗肿瘤作用。前期研究中,我们利用细胞膜表面易被生物素化以及生物素与链亲和素(Streptavidin,SA)天然强有力结合的特性,成功地将带有SA的细胞因子锚定于肿瘤细胞表面而制备成了一种新型肿瘤细胞疫苗。前期研究结果证实该疫苗能有效激活T细胞,但始终存在一部分小鼠的肿瘤消退不明显。程序性死亡因子1受体/配体(PD-I/PD-L1)是体内重要的协同刺激分子,已被证实可通过抑制T细胞的活化和增殖而负调控免疫应答。T细胞免疫球蛋白和黏附蛋白-3(Tim-3)是Tim家族成员之一,当与其天然配体半乳糖凝集素-9结合可引发辅助性T细胞功能下降,从而负性调节机体的抗肿瘤能力。结合我们前期研究工作和现有研究进展,本实验拟探究SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗治疗后小鼠TME中是否发生与PD-1、Tim-3表达相关的免疫逃逸;研究PD-1和Tim-3的表达对CD8-TILs功能的影响;评估PD-1、Tim-3序贯靶向阻断联合疫苗对晚期膀胱肿瘤的治疗效果,并探讨相关的免疫学机制。研究方法利用蛋白修饰细胞表面的技术制备SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗。通过对肿瘤大小的观察比较,以及CTL、流式分析、免疫组化、ELISA等检测方法,评估疫苗或疫苗联合靶向共刺激分子阻断治疗转移性膀胱肿瘤的效果以及探究相关的免疫学机制。研究结果1.通过已成瘤的小鼠皮下模型证实SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗能够通过诱导脾脏中DCs的成熟激活CD8+TILs,但无法明显抑制皮下已成瘤的肿瘤生长。2.该疫苗能够上调CD8+TILs表面PD-1和Tim-3的表达,同时也能以IFNy依赖的形式上调TME中PD-L1的表达。3.该疫苗联合抗PD-1抗体较单独治疗能够明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长,但总体应答率较低(12.5%)。4.PD-1靶向阻断能够上调CD8+TILs表面Tim-3的表达。5.PD-1+Tim-3+CD8+TILs的增殖和分泌能力明显低于其他亚型,PD-1lTim-3+CD8+TILs的分泌能力较低,但具备良好的增殖能力。6.抗PD-1抗体和抗Tim-3抗体序贯靶向阻断联合新型疫苗能有效增强机体对肿瘤细胞的特异性杀伤,降低促肿瘤生长的progranulin和IL-6的分泌,减少CD8+TILs的凋亡,从而有效抑制小鼠皮下肿瘤的生长,提高治疗的应答率(45.8%)。研究结论抗PD-1抗体和抗Tim-3抗体序贯靶向阻断联合SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗能够有效抑制晚期膀胱肿瘤的生长。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.14
【部分图文】：

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０?１０２?１０３?１〇４?ｔｏ５??ＰＥ??图２－１流式细胞仪检测膜修饰的ＭＢ４９膀胱肿瘤细胞疫苗表面ＧＭ－ＣＳＦ的锚定率（单??纯生物素化未结合细胞因子的ＭＢ４９膀胱肿瘤细胞作为对照组）??Ｆｉｇ?２－１?Ｔｈｅ?ｐｒｅｓｅｎｃｅ?ｏｆ?ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｏｆ?ＭＢ４９?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ａｓｓａｙｅｄ?ｂｙ?ｆｌｏｗ??ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ?（ｕｎｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ?ＭＢ４９?ｃｅｌｌｓ?ｓｅｒｖｅ?ａｓ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ）??２．２．２膜修饰的ＭＢ４９膀胱肿瘤细胞疫苗表面的ＧＭ－ＣＳＦ生物活性检测??按前述实验方法，将己制备好的ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ膜修饰的ＭＢ４９膀胱肿瘤细胞??疫苗细胞碎片悬液按不同浓度梯度加置９６孔培养板中，同时加入小鼠骨髓细胞??悬液共孵育，利用ＭＴＴ法检测小鼠骨髓细胞的增殖情况。利用ＳＰＳＳ１９．０统计??分析软件对数据进行析因设计的方差分析。结果表明：Ｆ涵＝３０１．６１５，?Ｐｍ＜０．０１；??Ｆ?浓度＝３４．１７４，?Ｐ?浓度＜０．０１；?Ｆ?组间Ｘ浓度＝?２１．５６５，?Ｐ＜０．０１。结果显示膜修饰的ＭＢ４９膀??胱肿瘤细胞疫苗表面的ＧＭ－ＣＳＦ具备良好的促进小鼠骨髓细胞增殖的能力，说??明锚定于ＭＢ４９膀胱肿瘤细胞膜表面的ＧＭ－ＣＳＦ能够保持良好的生物学活性（图??２－２，表?２－１）〇??１０??

具为游标卡尺，肿瘤体积的计算公式为：Ｖ＝ｋ／６?（ａｘｂ）?３／２?（Ｖ代表肿瘤体积，ａ??代表肿瘤长径，ｂ代表肿瘤短径）。利用统计软件ＳＰＳＳ?１９．０重复测量方差分析对??数据进行检验，结果显示（图３－１，表３－１）：?Ｆ賴＝９５．３０９，?Ｐ＜０．０１，?Ｆ?＿＝２９１３．５７５，??Ｐ＜０．０１，时间和肿瘤体积有交互作用，ＦＭｘＷｆｉ］＝?６７．６５７，?Ｐ＜０．０１，说明各个组的??小鼠皮下肿瘤体积差异明显，且各个组小鼠皮下肿瘤体积的差别在不同时间点??不一致，因此进一步对每个时间点的肿瘤大小分别比较，采用单因素方差分析??（Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ），结果显示：除第８天外，其余时间点ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ膜修饰??的膀胱癌肿瘤细胞疫苗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于其他组，具有统计学意义??２１??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Jennifer Kleponis;Richard Skelton;Lei Zheng;;Fueling the engine and releasing the break: combinational therapy of cancer vaccines and immune checkpoint inhibitors[J];Cancer Biology & Medicine;2015年03期

本文编号：2850510