药根碱靶向肿瘤蛋白TNIK抑制乳腺癌生长转移机制研究
发布时间：2020-10-29 22:47
乳腺癌是目前严重危害女性健康的恶性肿瘤之一,术后转移是其较难治愈的主要原因。肿瘤坏死因子受体相关因子-2与Nck互作的丝氨酸蛋白激酶(TNIK)是一种多效能的肿瘤靶蛋白,在乳腺癌组织中异常高度表达,TNIK可参与激活Wnt/β-catenin通路,对于乳腺癌的侵袭转移至关重要。药根碱属于原小檗碱型异喹啉类生物碱,该类生物碱对多种癌细胞均具有较强的细胞毒性作用。通过药物分子模拟对接显示TNIK可能是药根碱作用癌细胞的靶标抑制蛋白。因此解析TNIK调控乳腺癌转移的分子机制,探寻抑制乳腺癌侵袭转移的靶向药物,对于乳腺癌的治疗具有重要的意义。本研究利用基因编辑CRISPR/Cas9技术靶向敲除TNIK,建立稳定转染的癌细胞株MDA-MB-231/TNIK-KO及MDA-MB-231/TNIK-Control,通过免疫荧光及免疫印迹检测TNIK敲除后癌细胞内TNIK、p-TNIK及Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达情况,从而证明敲除TNIK可调控Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达及逆转上皮-间质转化(EMT),影响癌细胞的转移侵袭能力,且其效果可通过加入药根碱处理加强。同同时药根碱可显著抑制敲除细胞的生长增殖,诱导细胞发生凋亡。MTT、流式、免疫荧光及Western Blot实验结果表明药根碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7具有明显的毒性作用,能够抑制其生长,调控细胞的生长周期,诱导细胞线粒体膜电位发生改变,从而发生早期凋亡。再通过克隆形成、划痕愈合、免疫荧光及Western Blot实验证明药根碱能够破坏细胞膜骨架蛋白F-actin,调控TNIK蛋白表达破坏乳腺癌细胞的完整性,从而降低癌细胞的运动迁移能力。对于Wnt信号通路,药根碱能够调控关键蛋白β-catenin的表达使其下调,上调表达GSK-3β蛋白,并调控EMT上皮样E-cadherin蛋白表达显著增加,而间质样N-cadherin蛋白表达呈降低趋势,从而逆转EMT。此外,药根碱还能够逆转MCF-7/DOX细胞对化疗药物阿霉素的耐药性,并调控相关ATP结合盒转运蛋白的转录。以上结果在体内实验中得到进一步证实,药根碱能够明显抑制乳腺肿瘤组织的生长和转移,且对荷瘤小鼠无明显毒性。综上所述,药根碱对乳腺癌细胞的生长增殖都具有显著的调节作用,可以改变细胞迁移能力,阻滞细胞周期,最终引发细胞凋亡。而且药根碱能够靶向肿瘤蛋白TNIK,调控Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达,进一步逆转肿瘤细胞发生EMT。本课题的研究,可以为药根碱的抗肿瘤活性及抑制转移潜能相关研究提供实验基础,同时药根碱作为一种极有前景的新型TNIK抑制剂,有望应用于乳腺癌的靶向药物治疗。
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：
小分子结构药物，针对乳腺癌组织中对应的结构分子或相关蛋白质，与其结合，从而调控癌细胞的生长失控与远处迁移。由于这些特定的小分子靶向药物只在肿瘤细胞中表达，因此靶向治疗的药物的毒性要远远小于化疗药物，具有良好的应用前景。1.2 TNIK 促进癌症侵袭转移的分子机制及其抑制剂TNIK（Traf-2 and Nck interacting kinase）是由肿瘤坏死因子受体相关因子-2与 Nck 互作的丝氨酸蛋白激酶，1999 年被首次发现，由于在乳腺癌等实体癌组织中异常高度表达而引起广泛关注[25-27]。TNIK 编码含 1360 个氨基酸多肽链，其结构由 N 端激酶结构域、中间结构域和 C 端生发中心激酶结构域组成（图 1.1）。已发表文献证实 TNIK 是一种多效能的细胞因子，可通过 Wnt/β-catenin 通路对细胞的生长产生影响，与癌细胞增殖、EMT、细胞骨架构建及凋亡等生物学活性紧密相连[28-30]。Germinal center
浙江理工大学硕士学位论文 药根碱靶向肿瘤蛋白 TNIK 抑制乳腺癌生长转移机制研究Twist 结合 E-cadherin，结合盒启动子区的启动可抑制 E-cadherin mRNA 的转录，降低胞内 E-cadherin，同时高表达 N-cadherin，介导上皮细胞变得松散不易相连，改变极性，完成到间质的转变。基于以上报道，可推断 TNIK 通过 Wnt/β-catenin 通路调控 EMT 促进乳腺癌侵袭转移的作用机制为：TNIK 通过自身磷酸化破坏细胞膜骨架蛋白，导致膜上的 F-actin/E-cadherin/β-catenin 复合体解体，细胞骨架形态改变，黏附性下降；另一方面复合体的解构，使信号分子多分散在胞浆内，靶向 Wnt 信号通路基因，一部分信号分子通过核膜进一步调控结合 LEF/TCF4 转录因子，致使相关基因串联启动，发生 EMT，从而促进乳腺癌细胞的浸润转移（图 1.2）。因此，细胞膜骨架上的 TNIK 分子被磷酸化，可能是促进其异常激活 Wnt/β-catenin 通路诱导乳腺癌细胞发生 EMT 并侵袭转移的关键，此机制将在本研究中进一步得到证实。
图 1.3 药根碱与 TNIK 晶体结构的分子模拟模型Figure 1.3 Docked modeling of jatrorrhizine was performed using a TNIK crystal structure1.4 实验目的和意义乳腺癌作为危害女性健康的主要恶性肿瘤，术后肿瘤转移的特性也成为其难以治愈的难题之一。最新研究表明 TNIK 在乳腺癌等实体癌组织中异常高度表达，可激活 Wnt/β-catenin 通路，对于癌症的侵袭转移至关重要。前期研究已发
【参考文献】
本文编号：2861574
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：
小分子结构药物，针对乳腺癌组织中对应的结构分子或相关蛋白质，与其结合，从而调控癌细胞的生长失控与远处迁移。由于这些特定的小分子靶向药物只在肿瘤细胞中表达，因此靶向治疗的药物的毒性要远远小于化疗药物，具有良好的应用前景。1.2 TNIK 促进癌症侵袭转移的分子机制及其抑制剂TNIK（Traf-2 and Nck interacting kinase）是由肿瘤坏死因子受体相关因子-2与 Nck 互作的丝氨酸蛋白激酶，1999 年被首次发现，由于在乳腺癌等实体癌组织中异常高度表达而引起广泛关注[25-27]。TNIK 编码含 1360 个氨基酸多肽链，其结构由 N 端激酶结构域、中间结构域和 C 端生发中心激酶结构域组成（图 1.1）。已发表文献证实 TNIK 是一种多效能的细胞因子，可通过 Wnt/β-catenin 通路对细胞的生长产生影响，与癌细胞增殖、EMT、细胞骨架构建及凋亡等生物学活性紧密相连[28-30]。Germinal center
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【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 ;High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells[J];Science Foundation in China;2014年02期
2 严婷;张莲芬;张熔熔;冯磊;金坚;;人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/MDR~a的建立及其生物学特性的初步研究[J];细胞生物学杂志;2006年04期
本文编号：2861574
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