选择性突变片段扩增法在PIK3CA基因H1047R位点突变检测中的应用

发布时间：2020-10-31 17:51

　　 目的:建立一种新型方法用于提高PIK3CA基因(H1047R位点)突变检测敏感度。方法:通过亚克隆技术构建PIK3CA基因野生型DNA模板(含BseJI酶切位点)和突变型DNA模板。将PIK3CA基因野生型模板与突变型模板按照野生突变比(W:T)=100:1,300:1,1000:1的比例混合,并在高保真pfu DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增获得第一轮PCR产物。利用限制性内切酶BseJI将PCR产物酶切消化1h后过柱纯化,以2μl酶切产物为模板进行PCR扩增,过程中每10个循环加入BseJI限制性内切酶进行酶切消化1h,最后对其产物进行测序。结果:我们成功地构建带有PIK3CA基因H1047R突变位点的突变型质粒模板及其相应的野生型质粒模板。由于野生型片段包含限制性内切酶BseJI的酶切位点,在反应过程中,PCR扩增与反复的酶切消化联合作用能够选择性地扩增突变片段,而野生片段的扩增则受到抑制。在众多检测PIK3CA基因H1047R位点突变的方法中,与敏感性介于5:1-10:1的众多检测方法相比,该方法的敏感性可达1000:1,因而能够有效提高突变检测敏感度。结论:通过高保真DNA聚合酶、低温限制性内切酶、特异性引物等现有的技术材料,建立一种对PIK3CA基因H1047R这一热点突变高效、快速的检测方法,为肿瘤患者的早期诊断、个体化治疗及预后判断提供帮助。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R730.43
【文章目录】：
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Abstract
引言
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综述
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本文编号：2864297