抗人CCL22以及CCL17免疫毒素的表达纯化与体外功能验证

发布时间：2017-04-05 10:15

  本文关键词：抗人CCL22以及CCL17免疫毒素的表达纯化与体外功能验证，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：利用巴斯德毕赤酵母来表达抗人的CCL22以及CCL17免疫毒素,得到它们的单价以及双价免疫毒素,进行体外的功能验证以及单双价免疫毒素功能比较。方法：本试验利用毕赤酵母来生产抗人CCL22以及CCL17的单价和双价免疫毒素,需要经过两步纯化,第一步为镍柱纯化,第二步为离子柱纯化。利用SDS-PAGE凝胶电泳检测所得到免疫毒素分子量,最终Western Blot进一步鉴定蛋白。得到目的蛋白后,使用NHS-Sulfo生物素对其进行标记,以供流式细胞仪检测其与CCRF-CEM肿瘤细胞系的结合能力；使用3H同位素标记亮氨酸的方式检测两种单价免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞蛋白质合成的抑制能力；使用CellTiter-Glo试剂盒侦测CCRF-CEM肿瘤细胞中的ATP含量,来检测免疫毒素对其增殖的抑制作用。结果：本试验通过毕赤酵母成功表达了四种免疫毒素,即Anti-human CCL22单双价免疫毒素以及Anti-human CCL17单双价免疫毒素。这四种免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞均具有粘附能力,且双价免疫毒素的粘附能力大于单价免疫毒素；Anti-human CCL22及Anti-human CCL17的单价免疫毒素均能抑制CCRF-CEM肿瘤细胞蛋白质合成,且后者的抑制能力强于前者；所有免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞活力均具有抑制作用,且双价体的效力大于单价体。结论：本试验成功表达了抗人的CCL22以及CCL17的单价及双价共计四种免疫毒素,它们对于CCRF-CEM肿瘤细胞均具有粘附及增殖抑制作用,其中双价免疫毒素效果较为明显,这些结果可以为日后的癌症与肿瘤治疗提供一定的理论基础。
【关键词】：毕赤酵母 CCL22 CCL17 免疫毒素 肿瘤 流式细胞技术
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 摘要6-7
• 文献综述7-12
• 1 C-C趋化因子受体4及其相关配体的研究进展7-8
• 1.1 C-C趋化因子受体47
• 1.2 巨噬细胞源趋化因子7-8
• 1.3 胸腺活化调节因子8
• 2 调节性T细胞8-9
• 2.1 调节性T细胞简介8-9
• 2.2 调节性T细胞与C-C趋化因子受体49
• 3 免疫毒素简述9-10
• 4 毕赤酵母表达系统的简述10-11
• 5 试验设计11-12
• 前言12-13
• 试验部分13-44
• 1 试验材料13-17
• 1.1 细胞系13
• 1.2 主要试剂13-14
• 1.3 主要仪器与设备14-15
• 1.4 试剂配制15-17
• 1.5 数据处理软件17
• 2 试验方法17-25
• 2.1 Anti-human CCL22和Anti-human CCL17免疫毒素的表达17-20
• 2.1.1 目的基因的获取17-19
• 2.1.2 目的基因向酵母感受态细胞中的转化19
• 2.1.3 大批量表达19-20
• 2.2 蛋白质分离纯化20-21
• 2.2.1 第一步纯化(镍柱纯化)20
• 2.2.2 第二步纯化(离子柱纯化)20-21
• 2.3 BCA法测蛋白质浓度21-22
• 2.4 Anti-human CCL22及Anti-human CCL17免疫毒素体外功能试验22-23
• 2.4.1 Anti-human CCL22免疫毒素粘附试验22-23
• 2.4.2 Anti-human CCL17免疫毒素粘附试验(步骤同2.4.1)23
• 2.5 CCRF-CEM肿瘤细胞系的放射性同位素蛋白合成抑制试验23-24
• 2.6 Anti-human CCL22免疫毒素对肿瘤细胞活力抑制试验24-25
• 2.7 Anti-human CCL17免疫毒素对肿瘤细胞活力抑制试验(步骤同2.6)25
• 3 结果与分析25-37
• 3.1 PCR结果25-26
• 3.2 重组基因的双酶切验证26-27
• 3.3 免疫毒素蛋白纯化结果27-28
• 3.4 BCA法检测蛋白浓度28
• 3.5 Anti-human CCL22免疫毒素黏附试验流式细胞技术分析结果28-31
• 3.6 Anti-human CCL22免疫毒素粘附性解离常数(Kd)的计算31
• 3.7 Anti-human CCL17免疫毒素黏附试验流式细胞技术分析结果31-34
• 3.8 Anti-human CCL17免疫毒素粘附性解离常数(Kd)的计算34
• 3.9 CCRF-CEM肿瘤细胞系的放射性同位素蛋白合成抑制试验34-35
• 3.10 Anti-human CCL22免疫毒素对肿瘤细胞活力抑制试验35-36
• 3.11 Anti-human CCL17免疫毒素对肿瘤细胞活力抑制试验36-37
• 4 分析和讨论37-42
• 4.1 免疫毒素的表达和提纯37-38
• 4.2 蛋白标记生物素对免疫毒素的标记38
• 4.3 免疫毒素体外功能的验证38-42
• 4.3.1 Anti-human CCL22免疫毒素粘附试验39-40
• 4.3.2 Anti-human CCL17免疫毒素粘附试验40
• 4.3.3 CCRF-CEM肿瘤细胞系的放射性同位素蛋白合成抑制试验40-41
• 4.3.4 Anti-human CCL22免疫毒素对肿瘤细胞活力抑制能力试验41
• 4.3.5 Anti-human CCL17免疫毒素对肿瘤细胞活力抑制能力试验41-42
• 5 全文结论42-44
• 参考文献44-48
• Abstract48-50
• 致谢50

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